分类: 智能制造

逆转录(Reverse Transcription)是以RNA为模板,在逆转录酶的催化作用下,合成RNA/DNA杂合双链,然后水解杂合双链中的RNA,得到互补的单链cDNA的过程。得到的cDNA单链可以作为扩增模板,合成双链DNA。cDNA的合成可以用与后续的PCR实验、qpcr实验、基因检测、基因工程等各个领域。

图1:逆转录PCR的流程图(图片来源于网络)

逆转录实验成功的要素包含:逆转录酶、主要反应组分、引物的选择、gDNA去除等。

1.逆转录酶

大多数逆转录酶,主要包括以下三种活性:

①逆转录活性:以RNA为模板,催化dNTP聚合,生成DNA-RNA杂合双链。

②RNase H活性:水解杂合双链中的RNA,得到与RNA互补的DNA单链(cDNA)。

③DNA指导的DNA聚合酶活性:以cDNA单链为模板,以dNTP为底物,再合成双链DNA。

常见的逆转录酶包括AMV和M-MuLV逆转录酶,M-MuLV逆转录酶具有更高的热稳定性,并且降低了RNase H的活性。

表1:野生型M-MuLV和野生型AMV两种逆转录酶性能对比

 

2.单价阳离子

离子条件基本上影响各种模板的转录效率。K+的转录产物比Na+较长。对于cDNA长度的最适K+浓度为140-150 mM。

3.二价阳离子

对于反转录酶活性来说,二价阳离子也是必需的。产生全长cDNA产物的最适浓度是6-10 mM。

4.dNTP

四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)的浓度,对于有效合成cDNA是至关重要的。如果其中只有一种的浓度小于10-50 μM,cDNA的产量将明显下降。常用的dNTP的浓度为200-500 μM。

5.引物的选择

逆转录引物一般包含三种:oligo dT,随机引物(Random Primer Mix)和基因特异性引物(GSP)。客户可以根据个人需求进行选择。

表2:三种逆转录引物优劣势对比

6.gDNA 去除

污染性gDNA可能会干扰逆转录反应,并导致后续的PCR实验、qPCR实验结果出现假阳性、高背景或检测率降低等现象。通常在RNA提取过程中加入合适浓度的DNase I,37 ℃加热10~15 min,去除gDNA干扰。
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(链接:http://www.biomarker.com.cn/technology-services/fanzhuan),里面的重组M-MuLV逆转录酶,拥有较低的RNase H活性同时兼具较强的热稳定性。与野生型M-MuLV相比,重组M-MuLV逆转录酶可以在更高的温度下合成第一链 cDNA。该酶在高达48℃时仍具有高活性,强特异性和cDNA产量更高等优势。

表3:野生型和重组型M-MuLV逆转录酶性能展示

产品组分

表4:BiomarkerScript II Enzyme Mix逆转录试剂盒组分

性能展示

1.广泛的样本兼容性

可兼容不同样本,包括动物(小鼠、人、鸡、鸽子等)、植物(玉米、水稻、番茄等)样本

表5:分别以不同物种的总 RNA 为模板,逆转录得到cDNA。

2.热稳定性强

BiomarkerScript II逆转录酶是一种重组M-MuLV逆转录酶,拥有较低的RNaseH活性同时兼具增强的热稳定性。

图2:以1μl人肝癌细胞RNA为模板,用BiomarkerScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行逆转录,得到cDNA产物。再以100 ng cDNA为模板,用Biomarker HS 2× HF Master Mix进行PCR扩增,将得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳,结果所示:扩增条带单一且产量高。

3.高反转录酶的活性

该酶在高达48 ℃时仍具有活性,而且特异性和cDNA产量更高。较高温度下进行反转录,能够减少RNA的二级结构,增加反转录的效率。

4.扩增更长cDNA

可扩增长达10 kb的cDNA,用于基因克隆。

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