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提问1：我的qPCR实验结果，复孔重复新性差，具体是什么原因导致的？

回复： 1）误差导致，建议加样过程中，使用精密的移液器，且可增大反应体系。

2）仪器长时间未校准，建议将仪器定期校准。

提问2：扩增曲线未达到平台期，如何改善？

回复： 1）模板量太低，可适当增加模板量。

2）循环数太少，可适当增加循环数。

3）基因表达丰度低，建议增加模板量，或者选择合适的试剂盒，确保 能检测出较低基因的表达水平。

除此之外，在qPCR扩增实验过程中，还会出现Ct值偏大、特异性差、荧光强度弱、不适合特有的机型等问题。为了解决以上问题，百迈客推出的一款Biomarker 2× SYBR Green Fast qPCR Mix试剂盒，具有全平台通用、特异性强、扩增性能优越、灵敏度高等特点。

产品简介

Biomarker 2× SYBR Green Fast qPCR Mix采用SYBR® Green I 嵌合荧光法进行qPCR反应，通过对SYBR® / FAM通道进行荧光信号定量检测，可以获得PCR过程中DNA扩增的真实数据。Taq DNA酶采用抗体法热启动进行扩增，可以有效抑制引物退火导致的非特异性扩增，极大地提高产品的特异性。且试剂盒中含有特殊的ROX Reference Dye，适用于所有qPCR仪器。

产品特点

1.兼容性完美，全平台通用：提供ROX Reference Dye I和II预混液，适用于所有主流定量PCR仪器。

2.灵敏度高：采用独特优化的反应Buffer，可检测低至10 pg的cDNA模板。

 
图1：将质粒进行8个10倍梯度稀释，以5×107~100拷贝/µl的质粒为模板，进行扩增。发现扩增效率高，且可获得良好的线性关系。

3.扩增性能优越：短时间内可反复冻融10次以上，扩增曲线依然呈现特征单峰，扩增效率依然很高。

  

图2：以1 μg不同物种的RNA为模板（蓝色：人肝癌细胞；青色：鸡；红色：斑马鱼；黑色：水稻种子），用BiomarkerScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行逆转录，得到cDNA产物。再以100 ng不同物种的 cDNA为模板，用反复冻融10次以上的Biomarker 2× SYBR Green Fast qPCR Mix进行qPCR扩增。

4.特异性强，适应不同样本：通过抗体封闭聚合酶活性，有极强的特异性，可完美识别植物（种子、叶子、果实）、动物（细胞、组织）等样本的目标基因扩增。

图3：以1 μg不同物种的RNA为模板（红色：人肝癌细胞；蓝色：鸡；黑色：斑马鱼；紫色：水稻种子；黄色：番茄果），用BiomarkerScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行逆转录，得到cDNA产物。再以100 ng不同物种的 cDNA为模板，用Biomarker 2×SYBR Green Fast qPCR Mix进行qPCR扩增。

5. 重复性好 ：设置20个复孔，S型扩增曲线几乎重合。

图4：以1μg水稻种子的RNA为模板，用BiomarkerScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行逆转录，得到cDNA产物。再以100 ng的 cDNA为模板，设置20个复孔，用Biomarker 2× SYBR Green Fast qPCR Mix进行qPCR扩增。

转录组项目文章发表，大部分的验证都采用了qPCR方案，统计部分百迈客成功案例：人、鼠、家禽、水产、昆虫、经济作物、林木、花卉果蔬等。

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