2021年7月2日,上海交通大学医学院与北京百迈客生物科技有限公司合作的文章发表在NEURO-ONCOLOGY(IF 12.3)上,研究团队利用RNA-seq、ATAC-seq和Hi-C检测技术,揭示了骨微环境在脊索瘤发生中的作用,并将CA2蛋白确定为脊索瘤的治疗新靶点,此外,本研究还发现盐酸多佐胺可能为脊索瘤治疗提供新的选择。以下是对该文章的详细解读。

导读

脊索瘤是一种罕见的间充质恶性肿瘤,复发率高,致瘤机制不明确。遗传物质的改变、表观遗传调节因子和染色质空间构象在脊索瘤的发生和发展中起关键作用。本研究利用RNA-seq、ATAC-seq和 Hi-C技术对脊索瘤和人髓核(HNP)进行多组学检测,并结合影像学检查和临床信息,揭示了骨微环境在脊索瘤中的重要作用,并且发现CA2在脊索瘤中高表达,但在HNP中几乎不表达。本研究还发现可通过敲除基因或使用盐酸多佐胺等药物抑制CA2的表达,从而抑制脊索瘤细胞生长和迁移,此外,盐酸多佐胺还通过阻断骨髓单核细胞向破骨细胞的分化来调节骨微环境。综上,本研究通过结合多组学检测技术,最终揭示了骨微环境在脊索瘤发生中的作用,并将CA2蛋白确定为脊索瘤的治疗新靶点, 此外,本研究还发现盐酸多佐胺可能为脊索瘤治疗提供新的选择。

研究背景

脊索瘤是一种罕见的间充质恶性肿瘤,主要发生在中轴骨,如颅底蝶枕部和骶尾部。在治疗上,常规剂量的放疗和化疗对它没有作用,因此手术是主要治疗方法 ,但其复杂的解剖结构和相对较大的肿瘤体积使得肿瘤组织不能被切除干净,导致局部复发率高。因此,迫切需要探索脊索瘤潜在的致瘤机制和治疗新靶点。
在病理学上,脊索瘤起源于椎体内的脊索残留物,由胚胎晚期不完全挤压引起。脊索瘤的发生涉及到几个基因的异常表达,例如TBXT、CDKN2A和LYST。除了基因表达改变外,染色质可及性的改变,以及染色体构象的改变,如通过染色质折叠将线性距离较远的启动子、增强子和其他顺式调控区域聚集在一起等,这些改变对基因的调控也至关重要。
本研究利用RNA-seq、ATAC-seq和 Hi-C技术在脊索瘤和脊索来源的髓核中综合分析了基因表达情况和染色质可及性,结果表明骨微环境和骨骼系统发育在脊索瘤发生中的潜在作用。此外,通过比较差异表达基因(DEG),发现CA2在脊索瘤中高表达,其抑制剂盐酸多佐胺可靶向作用于CA2,从而抑制脊索瘤细胞增殖、迁移、致瘤性和破骨细胞分化。

实验方法

材料:细胞系(原代HNP细胞来自24周胎龄的流产胎儿的原代培养细胞;脊索瘤细胞系CH22获自脊索瘤基金会;骨髓单核细胞(BMM)来自C57/BL6小鼠股骨)
方法:RNA-seq、ATAC-seq和Hi-C

研究结果

1、HNP和CH22细胞的差异基因分析(DEG)

对CH22和HNP细胞的转录组数据进行比较分析,每种细胞类型内的重复间具有高度相关性(r2=0.9937 和 r2=0.9841)。与HNP相比,在CH22中鉴定了3,122个上调的基因和1,810个下调的基因,热图和火山图显示了几个重要的DEG,例如GDA、TBXT、CDKN2A和CDKN2B(图1A、B)。GO分析显示DEG与轴突发育和骨骼系统发育相关(图1C);KEGG富集分析发现,PI3K-AKT和MAPK信号通路在脊索瘤肿瘤发生中富集。


图1 RNA-seq和ATAC-seq数据分析

2、HNP和CH22细胞的染色质差异可接近性区域分析(DAR)

与HNP相比,在CH22中确定了313个增加的DAR 和 1,749 个减少的DAR。DAR的motif分析显示CTCF、Nkx2-2、Tcfe2a_2、MED-1 和 E2A motif在CH22中高度富集。还确定了DAR中的DEG,如GDA、TBXT和PAX1(图 1D)。GO分析显示DAR中的基因与骨骼系统发育有关(图 1E);KEGG富集分析显示这些基因富集在PI3K-AKT信号通路上。

3、HNP与CH22细胞间染色体相互作用差异

对CH22和HNP进行Hi-C染色体构象捕获测序,共获得1027和8.64亿个有效相互作用对。相互作用类型分析显示,HNP和CH22的平均顺反比分别为1.815和0.69,表明CH22中的染色体间相互作用更强。
染色体相互作用频率(IR)能够反映基因组区域在细胞核中的相对位置,与转录活性相关。在HNP的IR热图中,观察到在富含基因的短染色体(chr16、17、19-22)中IR较高,尤其是在chr21和chr22之间。在CH22中,chr3和chr15、chr5和chr20、chr2和chr4、chr9和chr13、chr12和chr16之间的IR更高,短染色体(chr16-22)之间的IR更低。IR强度和DEGs/DARs无显著相关性(p = 1)。

4、HNP和CH22细胞之间的结构变异

与HNP 相比,在CH22中发现了一些大的染色体结构变异,表明脊索瘤发生中会出现的几个染色体易位事件,例如chr2和chr4(图 2A)。在CH22中鉴定了8个明显的结构变异区域,如在Hi-C中观察到两个明显的相互作用区域R5(在chr2 R1和Chr4 R3之间)和R6(在chr2 R2和chr4 R4之间)。H2信号表明chr2和chr4之间在P1(chr2:55,540,000)和P3(chr4:156,520,000)位置发生了相互易位。位置P1和P2 (chr2:160,550,000) 之间的强相互作用信号(H1)表明Chr2中的倒位区域与易位区域相邻(图 2B)。此外,还发现了chr12中更强的染色体内相互作用信号(CNV 区域)(18,040,000-90,120,000bp,图 2C)和chr9中的缺失区域(21,640,000-25,360,000bp)。在 CNV 区域,有187个DEG,包括一些普遍报道的与脊索瘤相关基因,例如KRT8和KRT18(图 2D),临床样本进一步证实了它们在脊索瘤中高表达。在缺失区域,鉴定了9个DEG,包括肿瘤抑制基因,如CDKN2A和CDKN2B(图 2E)。基于GO和KEGG分析,发现CNV区域中的基因与骨骼系统发育和癌症中的蛋白聚糖通路相关(图 2F)。

图2 HNP和CH22细胞的结构变异分析

5、HNP和CH22细胞之间的compartments分析

常染色质和异染色质可分为两个区域,定义为compartments“A”和“B”。 脊索瘤A/B compartments的基因组和表观遗传特征表明,compartments A与较高的基因密度、转录活跃区域相关,而compartments B具有较差的基因密度、与转录非活跃区有关。

在肿瘤发生过程中,染色质compartments会进行转换。与HNP相比,CH22的每条染色体中都发现了compartments转换,尤其是在chr1、9、13-16和22(图3A)。HNP中9.99%的compartments A在CH22中为compartments B,6.06%的compartments B在CH22中为compartments A,从A到B的转换中基因的表达显著下调(p=1.08 e-74 ),反之亦然(p=4.11 e- 47 )。
进一步标记了441个基因从compartments B切换到compartments A(376 个下调和 65 个上调)和341个基因从compartments A 转换到compartments B(38 个下调和 303 个上调,图3B、C)。GO和KEGG分析表明它们与骨骼系统发育和致癌途径有关,如癌症中的PI3K-AKT信号和蛋白聚糖通路。


图3 细胞特异性compartments、TAD边界和Loop分析

6、HNP和CH22细胞之间特异TAD边界分析

compartments由TAD组成,它们在细胞类型和物种中是保守的。在肿瘤发生过程中,被破坏或新形成的TAD边界可能导致增强子和启动子之间的相互作用,并调节基因表达。本研究在HNP中检测到6,677个TAD,在CH22中检测到4,856个TAD。TAD 边界处基因和染色体开放富集区域的富集程度大于TADs内部。
研究确定了1,617个HNP特异边界和437个CH22特异边界,同时确定了位于HNP和CH22特异边界的588和62个DEG,包括CA3、RAB17和TRIB2(图3D,E)。GO和KEGG分析表明这些DEG与细胞外基质和细胞因子-细胞因子受体相互作用有关。

7、HNP和CH22细胞之间的特异Loop分析

在基因调控中,增强子通过染色质Loop激活启动子。本研究在HNP和CH22中分别检测到10,048和12,170个Loop,中位数长度为100,000 bp。通常认为,与增强子相关的Loop可以增加基因表达。本研究在HNP和CH22中分别鉴定了3,515和4,187个启动子-增强子loop(图3F)。其中,ATAC-seq峰分别支持2,495 和1,732个。此外,在CH22中发现了比HNP更多的启动子loop和增强子loop。
两种细胞类型中的loop是高度保守的,分别鉴定了1,226个HNP特异性loop和3,348个CH22特异性loop(图 3G)。在HNP特异性loop中,发现了45个在CH22中上调表达的基因和41个在CH22中下调的基因,以及CH22特异性loop中的75个CH22上调基因和129个CH22下调基因,例如 GDA、EEF1A2和ADAM12(图3H)。GO 和 KEGG 分析表明这些DEGs 与轴突发育、癌症中的蛋白聚糖通路和 PI3K-AKT 信号通路有关。

8、HNP与CH22细胞的多组学联合分析

为了探索潜在的治疗靶点,本研究结合了位于CH22和HNP细胞之间的compartments、细胞特异性TAD和loop中的重叠的DEG,鉴定到了两个重叠的DEG(图 3I),即CA2和THNSL2。基于GO和KEGG功能注释,发现骨骼系统发育在脊索瘤发生中的重要作用。此外,根据427名脊索瘤患者的影像学数据,发现所有脊索瘤均在骨结构中被识别,但并非源自HNP。在四个外部数据库中,骨骼是脊索瘤发生最常见的位置,比例分别为73.98%、79.18%、86.31% 和 86.06%。总的来说,在3169例脊索瘤患者中,2439个脊索瘤位于骨内,410个位于脑脊髓神经系统,159个位于鼻咽和蝶窦,147个位于软组织,6个位于胸腔,8个位于不明原发部位。

研究结论

本研究采用多组学技术,对脊索瘤和HNP中的基因表达、染色质可及性和染色质空间结构进行了综合比较分析,并进行了大样本量验证。结果不仅证明了骨微环境与脊索瘤发生的相关性,而且还确定了一个新的治疗靶点(CA2)。此外,研究结果还表明盐酸多佐胺有望成为脊索瘤的一种潜在治疗选择。

参考文献

Meng T, Huang R, Jin J, et al. The comparative integrated multi-omics analysis identifies CA2 as a novel target for chordoma. Neuro Oncol. 2021 Jul 2:noab156. doi: 10.1093/neuonc/noab156

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