百迈客全转录组产品优势

百迈客全转录组测序服务是一次检测,获得四种分子(mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA)信息,针对不同类型的RNA进行表达分析,结构研究以及全新转录本的发现,并结合竞争性内源RNA(ceRNA)机制,进行联合分析,深入挖掘转录水平调控网络,深度探究各类RNA分子的调控机制。分析内容如下:

导读

circRNA在多种生理过程中发挥着重要作用,因此许多疾病与circRNA有关,特别是癌症。前期已有大量研究发现肝细胞癌(HCC)中circRNA表达普遍下调,pre-mRNA 3′ 末端复合物参与circRNA环化并在 HCC 肿瘤发生中起重要作用。因此,本研究探索了CPSF4在circRNA 3′ 末端形成和剪切中的作用。临床研究表明,CPSF4在HCC中表达上调,CPSF4的高表达与HCC患者的不良预后相关。机制研究表明,CPSF4导致具有多聚腺苷酸化信号序列的circRNA降低,这类circRNA的减少导致miRNA的降低并破坏了HCC中miRNA介导的基因沉默。细胞培养和异种移植小鼠模型的实验表明,CPSF4促进HCC细胞的增殖并增强致瘤性。综上,在HCC中CPSF4通过抑制circRNA和破坏miRNA介导的基因沉默引发癌症。

实验方法

材料:5位术前未经治疗的HCC患者癌组织和癌旁组织样本;TCGA数据库数据

方法:转录组测序、circRNA测序、细胞迁移实验、生存分析

研究结果

1、circRNAs在HCC组织中下调

为了探索HCC中的circRNA表达谱,本研究分析了几个公开可用的数据,包括GSE94508、GSE97332和GSE14520,结果显示在3个GEO数据库中,HCC的circRNA表达水平下降。尽管通过选择性剪接和多聚腺苷酸化导致广泛的RNA缩短是癌症中的常见现象,但circRNA的长度分布没有改变,并且所有长度的circRNA表达水平都下降。PAS序列是多聚腺苷酸化剪切的核心元件,分析表明HCC组织中的circRNA无论是否含有PAS序列均显著下调。然而,在3个GEO数据库中,含有PAS的circRNA的平均水平显著低于不含PAS的circRNA,这表明PAS介导的剪切在circRNA形成中起重要作用。综上所述,HCC组织中circRNAs整体减少,PAS介导的RNA裂解可能是导致circRNA下调的原因之一。

2、CPSF4高表达与HCC患者的不良预后相关

由于CPSF4表达在HCC中显著增加,并且其高水平表达对应于HCC中OS的最高风险,因此本研究将重点放在CPSF4上。通过比较50对配对的序列数据,发现HCC肿瘤组织中CPSF4表达水平显著高于正常邻近组织。来自GSE49515的微阵列数据还表明,10名HCC患者的外周血单核细胞(PBMC)样本中的CPSF4水平显著高于10名健康对照,这表明CPSF4可以作为HCC诊断的生物标志物(图 1A)。Kaplan-Meier对364例患者的生存分析显示,5 年生存率从 CPSF4低表达患者的57%±5%下降到CPSF4高表达患者的42%±5%(p < 0.01,图 1B)。进一步的相关分析表明,CPSF4与临床TNM分期、病理分级和临床分期显著相关(图 1C)。单变量分析表明HCC患者的OS率与高CPSF4表达之间存在关联(p < 0.01)。多变量Cox回归分析显示CPSF4水平(p = 0.03)是OS的独立预后因素(图 1D)。

通过对临床标本的分析进一步验证了生物信息学结果。本次检测的5个样本中,CPSF4的蛋白质印迹显示,与癌旁组织相比,HCC癌组织中表达更高(图 1E)。此外,细胞系中CPSF4的蛋白水平也显示CPSF4在所有HCC细胞系(Hep3B、Bel7402、Huh7、HepG2和Bel7404)中均高表达,但在正常肝细胞L02中几乎检测不到(图 1F)。在5个HCC细胞系中,HepG2的CPSF4表达水平最高,而Bel7402的水平最低。在Bel7402和HepG2细胞中构建了CPSF4敲低和过表达细胞,但由于Bel7402中的CPSF4表达非常低,所以无法检测到Bel7402-KD细胞中的敲低效率;虽然HepG2中的CPSF4表达非常高,但在HepG2-OE细胞中的过表达效率也非常低。因此,大部分CPSF4 KD实验是在HepG2细胞中完成的,而大部分CPSF4 OE实验是在Bel7402细胞中完成的。由41对组织样本组成的人类HCC组织微阵列的免疫组化(IHC)染色结果也证实了HCC组织中CPSF4的上调。在41个患者中,25个HCC组织表现出CPSF4高表达。相比之下,大多数癌旁组织显示出弱或中等的CPSF4表达(图 1G)。相关性分析还表明,CPSF4表达与临床TNM分期、病理分级和临床分期显著相关(图 1H)。

图1 CPSF4在HCC组织中高表达,并提示HCC患者预后不良
3、CPSF4降低HCC细胞中circRNA的表达水平

由于CPSF4负责PAS剪切,因此本研究假设CPSF4的增加加速了circRNA的降解并降低了它们在HCC细胞中的水平。为了验证这一假设,提取CPSF4-KD HepG2细胞、CPSF4-OE Bel7402细胞及其阴性对照的总RNA,并通过高通量测序进行分析。结果显示,在CPSF4-OE细胞中检测到下调circRNA(1058)多于上调circRNA(821),并且circRNA的平均表达水平显著降低。相比之下,CPSF4-KD细胞中大多数circRNA(5005个circRNA中的3221个)上调,circRNA的平均表达水平显著增加(图2A,B)。通过生物信息学分析发现,CPSF4主要抑制外显子circRNA,只有一小部分circRNA是内含子或内含子-外显子circRNA。CPSF4-OE细胞和CPSF4-KD细胞中circRNA的长度分布均未改变(图 2C),但CPSF4调节后的circRNA变化依赖于PAS。首先,在4种细胞系中,含有PAS的circRNA的表达显著低于不含PAS的circRNA;其次,CPSF4-KD细胞含有PAS序列的circRNA明显上调,但在没有PAS序列的circRNA中没有检测到变化(图 2D)。而在CPSF4-OE细胞中带有或不带有PAS序列的circRNA都减少了,推测在高表达水平CPSF4的存在下,除了6个传统PAS序列之外的一些非特异性PAS序列也可以被剪接。

为了验证,本研究首先从GEO数据库中选择了HCC组织中807个下调的circRNA(FC>2,p<0.05);然后从RNA-seq数据中筛选了1447个在CPSF4-OE细胞中下调或在CPSF4-KD细胞中上调的circRNA。这两组数据取交集,共得到24个circRNA作为验证的候选circRNA;结构分析表明其中16个含有PAS序列。实时PCR结果显示,这16个circRNA中有13个在CPSF4-OE细胞中被抑制,但在CPSF4-KD细胞中被激活(图 2E)。选择2个带有PAS元件的circRNA,hsa_circ_0027774 和 hsa_circ_0004913 作为CPSF4靶向的circRNA;同时,另一个广泛研究的不含PAS元件的circRNA hsa_circ_0001946作为CPSF4非靶向circRNA。Northern blot结果表明hsa_circ_0027774和hsa_circ_0004913与CPSF4呈负相关,但hsa_circ_0001946在所有细胞系中保持相同水平(图 2F)。同时构建了这三种circRNA的OE质粒并与CPSF4 OE或KD质粒共转染,real-time PCR结果显示带有PAS的circRNA(hsa_circ_0027774和hsa_circ_0004913)与CPSF4水平呈负相关,而不含PAS的circRNA(hsa_circ_0027774和hsa_circ_0004913)不受CPSF4的影响(图 2G),这说明CPSF4在转录后抑制了circRNA。总之,CPSF4直接调节HCC细胞中带有PAS元件的circRNA的表达。

图2 CPSF4可减少HCC细胞中的circRNA生物合成
4、CPSF4介导的circRNA减少可以导致miRNA的减少并破坏miRNA介导的基因沉默

为了测试CPSF4介导的circRNA减少是否会影响miRNA的稳定性,从CPSF4-OE和CPSF-KD细胞中提取总miRNA,结果显示CPSF4-OE细胞中miRNA(4-40 nt)和tRNA(40-80 nt)的比率降低,但在CPSF4-KD细胞中增加(图 3A-C),这证实了CPSF4能够减少miRNA的积累。

与其他癌症一样,HCC中的miRNA表达水平整体下降。大多数下调的miRNA与本研究之前筛选的807个下调的circRNA互补。选择与hsa_circ_0004913部分互补的hsa-miR-383-5p、hsa-miR-142-5p,以及与hsa_circ_0027774部分互补的hsa-miR-450b-3p和hsa-miR-145-5p作后续分析。实时PCR显示4种miRNA在CPSF4-KD细胞中均增加,而在CPSF4-OE细胞中减少(图 3D)。HepG2细胞中的circRNA探针证实hsa-miR-145、hsa-miR-450b与hsa_circ_0027774结合,而hsa-miR-142、hsa-miR-383与hsa_circ_0004913结合。AGO2免疫沉淀(RIP)结果显示hsa_circ_0004913、hsa_circ_0027774及其结合的miRNA在AGO2抗体相关复合物中特异性富集,但在对照IgG中没有富集。在CPSF4-KD细胞中,与对照相比hsa_circ_0004913/has-miR-383和hsa_circ_0027774/hsa-miR-145对增加;但在CPSF4-OE细胞中减少,这表明CPSF4介导的circRNA减少也影响了miRNA的积累。miR-383直接靶向HCC中的PARP2,而PARP2参与HCC的发展;miR-145直接靶向CDCA3,CDCA3降低了HCC患者的生存时间。荧光素酶测定证实miR-145可以沉默CDCA3的表达,miR-383可以沉默PARP2的表达。生物信息学分析显示,PARP2的3′-UTR中有2个miR-383结合位点,CDCA3的3′-UTR 中有2个miR-145结合位点。此外,这2个基因在HCC中均过表达,并与HCC患者较短的OS相关。通过蛋白质印迹检测,发现PARP2和CDCA3蛋白也在CPSF4-KD细胞中降低,而在CPSF4-OE细胞中增加(图 3E)。此外,这2种蛋白的表达与HCC中CPSF4的表达呈正相关。所有这些数据都证实了CPSF4介导的circRNA减少破坏了miRNA介导的基因沉默。

 

图3 CPSF4减少了miRNA的积累和基因沉默
5、CPSF4拮抗hsa_circ_0004913的肿瘤抑制作用

在Bel7402和HepG2细胞中生成hsa_circ_0004913-OE细胞,然后用CPSF4质粒转染。分别通过蛋白质印迹和实时PCR检测每个细胞系中的CPSF4蛋白和hsa_circ_0004913表达水平(图 4A,B)。与对照细胞相比,hsa_circ_0004913-OE细胞显示出较慢的增殖和较低的克隆形成。然而,CPSF4的OE可以消除hsa_circ_0004913的肿瘤抑制作用,因为CPSF4转染后生长速度和克隆形成能力恢复(图 4C,D)。这些结果表明circRNA在CPSF4介导的HCC细胞肿瘤发生中的重要作用。

图4 CPSF4拮抗hsa_circ_0004913的肿瘤抑制作用

文献下载:

https://international.biocloud.net/zh/article/detail/34103682

百迈客第八届全国功能基因组学高峰论坛

1 峰会介绍

第八届全国功能基因组学高峰论坛将于2021年10月18-22日震撼开启。该峰会是中国基因产业具有影响力的行业峰会之一,为展示我国功能基因组学在多组学和大数据背景下重大研究进展,促进功能基因组学各研究领域的交流与合作,加强行业信息与资源的共享以及成果转化,特举办本次高峰论坛,论坛规模逾1000人,在最新高通量测序技术、多组学分析方法及生物云蓬勃发展的背景下,本届大会将邀请各界领域领军者共同探索功能基因组学的新技术和新思路,以及大数据时代下的功能基因组学发展方向与未来!

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