浅谈基因测序

1869年，Friedrich Miescher 发现和分离出脱氧核糖核苷酸，人类对生命的研究开始向分子方向启程，自1977年Sanger发明了双脱氧链终止法一代测序技术开始，涌现出GS FLX，Solexa，SOLID，PicBio，Oxford Nanopore Technologies（ONT）多种测序平台，测序技术发展至今已有四十多年时间，而每次新兴平台的出现，无不显现出生物领域人类文明的又一次大的向前迈步，是人类科技奋斗史中的里程碑。而也正是一代代测序技术的发展和我们一代代科学家不断努力，测序技术被不断应用于基因组组装，功能基因定位，进化分析，育种以及精准医疗等领域，为人类的生活带来一次次便利的同时也带来了无限可能。

第一代测序技术应用了Sanger双脱氧链终止法，它的读长可达1000bp，准确率高达99.999%，但测序前需要对特定区段进行引物设计且通量低，很难应用于组学方面的研究。基于此特点，涌现出二代测序技术，它主要的特点为短读长，高通量。以Illumina Solexa为例，它采用边测序边合成的方法，首先利用超声波将DNA打断成200-500bp小片段文库，加接头后DNA片段随机附着于flowcell表面，经过桥式PCR扩增形成“DNA簇”，实现碱基信号强度放大，采用边合成边测序的方法，进行全基因组全面，准确的测序。

 

图1  NovaSeq 6000

百迈客目前主要应用2017年Illumina平台推出的NovaSeq系列测序平台，虽然较于以往二代平台，它的测序质量值、Index的测序识别、DNA文库冗余度等指标有了明显提升，但无法克服短读长的reads 在基因组组装、大片段变异检测、转录组、甲基化等研究中的短板。基于此情况，三代测序应运而生。

目前，三代测序的主要代表为PicBio和Oxford Nanopore Technologies（ONT）这两大测序平台，以ONT平台为例，它主要通过电信号识别碱基序列，单链DNA/RNA通过纳米孔（蛋白通道），不同的碱基会形成特征性离子电流变化信号，通过对这些信号的检测，得到碱基序列，完成测序。与二代相比，它主要的优势在于在测序前，不会将DNA样品打断成小片段，而是对我们提取DNA进行片段筛选，一般筛选10-100kb大小的片段进行测序，这就对我们前期提取的DNA质量要求较高。

三代测序技术的出现，为复杂的多倍体基因组组装带来了福音。这种基因组由于倍性多，重复序列高，而二代测序局限于产生单倍体间的共有序列，导致此类物种的研究停滞不前。而ONT平台由于其长读长，跨越完整的重复区域，大的结构变异也得到了很好的检测。eg. 纳米孔测序技术可以将T-DNA结构的分辨率提升到36Kb。这就意味着，在这类突变体功能基因定位时，可以直接通过测序的方式，找到材料中T-DNA的插入位置及拷贝数，从而找到功能基因，实现基因克隆。和传统的图位克隆比较，将大大缩短定位周期。传统的自然突变材料，如果已经有定位区段，应用二代检测SNP，ONT检测SV的方式可以让我们的功能基因克隆方面事半功倍。

在基因组组装方面，以生菜基因组为例，短读长的二代测序组装出21116个contig和2.21G的基因组，基于ONT平台，则产生了1169个contig，contig N50为7.3Mb。二代数据产生了想较于三代数据18倍的contig用于基因组组装，而三代平台读长的优势为高质量的基因组组装提供了便利。在转录组研究方面，ONT平台的长读长可以为我们带来完整的转录异构体的序列，且可做定量研究，这将避免二代短片段数据在转录本组装上的错误，更好的应用于转录组研究。

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