百迈客土壤微生物多样性成功案例，影响因子6.51

研究背景

由于砷污染对世界范围内的食品安全和人类健康造成的威胁，稻田砷污染越来越受到人们的关注。间歇性洪水和周期排水对稻田砷的影响显著。特别是稻田的洪涝条件会导致砷As(III)的释放，进而被水稻吸收。膳食大米已经成为人体砷的主要来源，因此，了解缺氧水稻土壤中砷的释放机制对砷污染稻田的修复意义重大。

生物炭是有机物在低氧条件下热解产生的固体富碳物，近年来，因其在农业和环境方面的效益而被广泛关注。生物炭可以提高土壤固碳能力，改善土壤质量，提高作物产量。生物炭的pH值、吸附能力、表面积、阳离子交换能力和微孔体积较高，能够去除土壤中的重金属污染物。此外，生物炭也可以通过加强电子转移来促进金属反应。研究表明，生物炭修正引起砷(As)大量释放的原因，主要是由微生物群落的转移和铁Fe(III)还原菌丰度的增加导致的。

在稻田中，砷的释放与氧化铁的氧化还原反应密切相关，金属还原菌能够通过金属呼吸作用控制金属污染物的转移。简单来说，排水后的稻田As(V)转移率较低，这是因为Fe(III)氧化物可以高度吸附As(V)，限制了砷的转移，然而洪涝爆发时，微生物介导的Fe(III)还原作用会将吸附的As(V)释放到水中，同时，吸附和释放的As(V)能够被As(V)还原菌异化还原为As(III)。有些异化As(V)呼吸菌也是铁还原菌（如Geobacter和Shewanella），它们可以同时释放Fe(II)和As(III)。研究表明，生物炭修正后的砷污染水稻土壤中，梭菌（Clostridium）、芽孢杆菌（Bacillus）和喜热菌属（Caloramator）占主导地位，地杆菌（Geobacter）、

厌氧粘细菌（Anaeromyxobacter）、Desulfosporosinus和土地杆菌（Pedobacter）丰度也升高。目前，生物炭修饰对水稻土壤砷转移的影响，以及对砷污染水稻土壤微生物群落的转录活性和功能的影响仍不清楚。16s rRNA测序和转录组定量被认为是描述活跃菌群和微生物活性的更好指标。

研究目的

本研究以受砷污染的水稻土壤为材料，采用生物炭进行厌氧微生物试验。其目的在于：1. 通过监测生物炭修正和无生物炭的微环境中砷和铁形态的动态变化，评价生物炭修正对缺氧水稻土壤中的砷生物地球化学的潜在影响；2. 通过16S rRNA高通量测序技术，调查砷转化过程中的活性菌群多样性；3. 利用RT-qPCR定量分析主要的砷相关细菌的转录水平及潜在作用，进一步分析砷转移与转录水平之间的相关性。

材料与方法

1. 土壤、生物炭和微环境

土壤样品取自于汕头市莲花山钨矿下游的砷污染稻田，运回实验室后低温保存；生物炭制备于产自马来西亚的油棕纤维；：将水稻土壤与30℃去离子水共孵育3周，激活土壤微生物，消耗原生电子受体，模拟稻田的淹水环境；厌氧微环境试验：120mL血清瓶，70mL培养液（30 mM PIPES缓冲液，pH 7.3），7g水稻土壤（湿重），氮气隔离，1 mL/L微量元素溶液，1 mL/L维生素溶液，10 mM 乳酸，30℃静置过夜；设置3个分组：3%（w/w）生物炭修正的水稻土壤、无生物炭修正的水稻土壤（对照组）、无菌土壤（对照组）（γ射线辐射处理）；每个采样周期（第0、1、2、5、10和20天）采集3个微环境样品，提取总RNA，检测砷和铁的形态变化。

2. 砷和铁的形态变化

高效液相色谱结合氢化物发生原子荧光的方法(HPLC-HG-AFS)。

3. RNA提取和反转录

MoBio试剂盒提取土壤样本的总RNA，Prime Script RT试剂盒（Takara）反转录为cDNA。

4. 活性微生物的菌群结构

16s rRNA V4（515R/806F），illumina PE250，QIIME 1.8.0，RDP数据库。

5. 金属还原相关菌的检测

使用Geo494F/Geo825R、Chis150f/ClostIr、FAc12-66F/FAc12-432R和She120F/She220R这4对引物，分别对地杆菌（geobacter）、希瓦氏菌（Shewanella）、梭菌（clostridium）和厌氧粘细菌（Anaeromyxobacter）进行实时荧光定量PCR（RT-PCR），分析这4种金属还原菌的丰度。

结果与分析

1. 砷和铁的释放

从图1a和1b来看，生物炭修正的水稻缺氧土壤中，Fe(III)的还原与As(V)的解吸或释放均被促进，As(III)的浓度与Fe(II)的浓度密切相关，Fe(III)和As(V)的降低是同时发生的；从图1c来看，在整个孵育期间，无菌土壤中均未观察到铁和砷的明显释放，表明铁和砷的降低是由微生物导致的。

 图1. 不同孵育阶段，生物炭修正（a）、无生物炭修正（b）和无菌（c）水稻土壤的释放性砷As(III)/As(V)和铁Fe(II)/Fe(III)的浓度。

2. 活性微生物的菌群结构

α-多样性分析结果表明，水稻土壤的生物炭修正组、无生物炭修正和无菌组的Chao1指数、Shannon指数、Simpson指数和物种数目均无显著性的差异，表明生物炭修正对水稻土壤微生物菌群多样性的影响微乎其微。在门水平，生物炭修正组和无生物炭修正组中厚壁菌门（firmicutes）的丰度差异可能与生物炭有关（图2）；在属水平，生物炭修正提高了水稻土壤中的地杆菌（Geobacter）、厌氧粘细菌（Anaeromyxobacter）和梭菌（clostridium）的丰度（图3），这3种菌均与砷、铁的还原有关。

图2. 生物炭修正（a）、无生物炭修正（b）水稻土壤的“门”和“纲”水平活性微生物的相对丰度。

图3. 生物炭修正（a）、无生物炭修正（b）水稻土壤的“属”水平活性微生物的相对丰度差异比较（“*”号表示p＜0.05。

3. 金属还原菌的转录水平活性

在生物炭修正组中，地杆菌（geobacter）相对转录丰度显著高于对照组（无生物炭修正组）（图4a），表明生物炭显著提高了水稻土壤中地杆菌（geobacter）的转录活性。此外，生物炭对孵育初期的厌氧粘细菌（Anaeromyxobacter）和希瓦氏菌（Shewanella）的转录也有积极影响，然而抑制了对菌（clostridium）的转录水平（图4b-d）。

在生物炭修正组中，地杆菌（geobacter）的转录水平与砷As(V)的释放浓度显著正相关（Pearson，R=0.98，p＜0.001；Spearman，R=1，p＜0.001），梭菌（clostridium）的转录水平与铁Fe（III）的释放浓度显著负相关（Spearman，R = 0.829 ，P < 0.05）。由此可见，在生物炭修正的水稻土壤中，地杆菌（geobacter）和梭菌（clostridium）可以通过提高转录水平快速响应砷As(V) 和铁Fe(III)的释放。

图4. 生物炭修正与无生物炭修正的水稻土壤的（a）：地杆菌（geobacter）；（b）梭菌（clostridium）；（c）厌氧粘细菌（Anaeromyxobacter）和（d）希瓦氏菌（Shewanella）的相对转录丰度。

表1. 地杆菌（Geobacter）、 梭菌（Clostridium）、厌氧粘细菌（Anaeromyxobacter）和希瓦氏菌（Shewanella）的相对转录水平与释放砷As(V)和铁Fe(III)的Pearson和Speraman相关性检验.

研究结论

本文以砷污染的水稻土为研究对象，通过构建厌氧微环境，探究生物炭存在下的砷转移、活性菌群变化及它们的转录活性水平。结果表明，与对照相比，生物炭可以促进微生物对砷As(V)和铁Fe(III)的还原，提高土壤溶液中的砷As(III)释放。提取环境样本中的总RNA研究微生物的群落结构，与对照组相比，生物炭提高了地杆菌（geobacter）、厌氧粘细菌（Anaeromyxobacter）和梭菌（clostridium）3种与砷、铁相关的细菌。RT-PCR结果表明，生物炭显著促进了地杆菌（geobacter）的转录水平。此外，在生物炭修正的微生境中，地杆菌（geobacter）的转录水平与砷As(V)含量，梭菌（clostridium）的转录水平与铁Fe(III)含量均呈显著的负相关性。总之，生物炭能够通过促进金属还原细菌的活性提高砷As转移，地杆菌（geobacter）和梭菌（clostridium）分别能降低生物炭中的砷As(V)和铁Fe(III)含量。

参考文献：

Qiao J T , Li X M , Li F B . Roles of different active metal-reducing bacteria in arsenic release from arsenic-contaminated paddy soil amended with biochar[J]. Journal of Hazardous Materials, 2017:S0304389417308476.