1.石蜡包埋组织
1.1适用空转产品
百创S3000（全物种）
10x Visium HD（人鼠）
Xenium（人鼠）。
1.2收样时间
本指南针对样本为石蜡块或组织贴芯片寄送，如果有特殊情况需要上门服务，请与技术人员确认实验室仪器设备情况。组织寄送前请至少提前1周进行预约，百迈客接收到样本并确认样本无异常后，3-5天内安排RNA质检并反馈质检结果，质检合格后安排后续实验。
1.3样本要求
1.3.1组织取样后应尽快使用10%福尔马林或4%多聚甲醛（PFA）固定12-48h（参考各医院病理科样本固定的方法），其他固定条件建议先咨询或自行承担风险，优先推荐使用10%福尔马林固定；
1.3.2蜡块制作后需封蜡，避免出现组织风干、被腐蚀、发霉等情况；
1.3.3样本处理需保持组织原有结构，蜡块被包埋组织体积需要>0.5cm3；
1.3.4蜡块制作可参考各医院病理科制作蜡块的流程，制备方法可参考本手册1.4部分，要求脱水充分、浸蜡充分，切片可连续成片、无裂痕和空腔（组织本身自带除外），样本切片过程中不会与外部包埋的蜡分离。组织尺寸不应超过0.9cm×0.9cm×2cm，组织切片/芯片面积不应超过80%，样本过满会影响切片效果。
1.3.5为保证样本质量，降低实验风险，建议切取6-10片5μm厚的组织片（切片应包含完整的组织结构），放入1.5mL 离心管中（可存放于-80℃1个月），以便进行total RNA的提取和质量检测。DV200 ≥ 50%可进行后续实验操作，50%≥ DV200 ≥ 30%属于风险样本，需要与老师沟通是否上机。
1.4石蜡样本制备过程
石蜡样本的制备条件因实际组织类型、大小的不同，固定条件不等，以下方案仅供参考，需根据实际情况而定。
(1)取材及固定
取材后修剪至适合的大小，建议厚度2-5mm。将材料固定在10%甲醛或4%多聚甲醛，固定时间12-24h，最好不超过24h。
(2)脱水
固定后的组织中含有比较多的水分，使用不同浓度梯度(70％，80％，90％，2*95％和2*无水酒精的脱水程序)的乙醇对组织进行脱水，以确保组织中的水分完全去除干净，为后续的透明及浸蜡做好准备，时间从几十分钟到数小时不等。
(3)透明
脱水后的组织块放入二甲苯等透明剂中透明处理，通常浸泡两次，每次十几分钟。
(4)浸蜡
将透明后的组织块放入低熔点石蜡与二甲苯的混合液中，再逐步过渡到纯石蜡中恒温操作，温度通常在58℃-60℃左右，每次浸泡1-2h，多次浸蜡确保组织充分浸透石蜡。
(5)包埋
预先准备好包埋模具，将熔化的石蜡倒入模具中，迅速用镊子将组织块放入模具中的合适位置，注意组织的切面方向，期间组织可能会移位，需要调整合适位置。石蜡冷却凝固后，从模具中取出包埋好的组织蜡块，做好标记。
1.5样本的保存与运输
1.5.1 蜡块样本的保存与运输
保存条件：蜡块存放于 4~8℃。
运输条件：
a. 蜡块放入密封袋中密封，根据寄送距离和时间，选择大小合适的泡沫盒，其厚度不低于 3 cm，且封口严实，保证泡沫盒密闭，避免直接暴露阳光下；
b. 寄送使用冰袋寄送，寄送时间>24h，应不少于6块冰袋（13 cm×23 cm）；
c. 样本做好防撞措施，建议使用泡沫、发泡纸等多层包裹以避免运送过程中碰撞影响样本；
d. 夏季因外界温度较高，可适当增加冰袋数量，确保样本运输过程中温度仍处于 2~8℃。
1.5.2 质检蜡片的保存与运输
1.5.2.1保存条件：
用于 FFPE样本RNA完整值DV200质检的蜡片应保存在1.5mL离心管中，外标签处写明样本名称和日期，装入自封袋密封保存。
1.5.2.2运输条件：
建议干冰运输，以防RNA降解。
1.5.3 组织贴芯片样本的保存与运输
1.5.3.1保存条件：
1.5.3.1.1组织石蜡块切片（5μm）后应将所需捕获的区域贴至粘附载玻片的指定区（红框标注处对应的芯片位置），箭头处可标记样本信息，便于后期核对；
注：需要捕获的组织区域应尽量贴片至捕获区域中央，所需玻片可提前邮件申请寄送。
1.5.3.1.2将FFPE组织中选择上机的位置贴在框线内，42℃烘箱/烤片机中烤片处理 3h后，放置于芯片盒或50ml离心管中，保存在4°C冰箱；
1.5.3.1.3若样本之前已染过HE，可先选择区域，而后重新贴白片，将所需位置贴于区域内，42℃烘箱/烤片机中烤片处理3h，室温过夜干燥后送样。若样本之前未染过H&E，可先切白片至公司进行HE染色后选择区域，再重新切片，将确定好的位置贴于红色区域内，42℃烘箱/烤片机中烤片处理3h，室温过夜干燥后送样。贴有组织的芯片放入芯片盒或50ml离心管中在室温干燥器中可保存2周。
1.5.3.2运输条件：
1.5.3.2.1样本封装
将贴好组织的玻片放入芯片储存盒，随后将芯片盒置入硬质盒内，防止受压变形；盒内放入干燥剂，确保芯片保持干燥。
1.5.3.2.2防撞防护
对装有芯片的硬质盒做好多层防撞包裹，建议使用泡沫、发泡纸等材料，避免运送过程中因碰撞损伤样本。
1.5.3.2.3装箱与控温
将包裹好的样本放入泡沫箱，确保温度为 4℃左右用于邮寄：依据寄送距离与时长，选用厚度不低于3cm、封口严实的泡沫盒，确保箱体密闭；夏季外界温度较高时，需在泡沫箱内放置冰袋，进一步维持低温环境，避免样本处于高温条件。
2.OCT包埋冰冻组织
2.1适用空转产品
百创S3000转录组（全物种）
百创空间免疫组（人）
百创空间ATAC（人鼠）
10x Visium HD（人鼠）
Xenium（人鼠）。
2.2收样时间
本指南针对样本为组织寄送，如果有特殊情况需要上门服务，请与技术人员确认实验室仪器设备情况。组织寄送前请至少提前1周进行预约，百迈客接收到样本并确认样本无异常后，3-5天内安排RNA质检并反馈质检结果，质检合格后安排后续实验。
2.3样本要求
2.3.1 10x空间转录组每块组织样本长宽不宜超过 6.5*6.5mm，百创S3000空间转录组每块组织样本长宽不宜超过 6.8*6.8mm，厚度＞1.5mm，S4000空间转录组每块组织样本长宽不宜超过11*11mm，组织截面覆盖小于25%的组织，建议多个包埋成一个OCT 包埋块，组织间隔尽量小，但是不要重叠，多个组织保持在一个水平面充分利用捕获区域。
2.3.2 在样本量足够的情况下，每个动物样本最好准备至少2个包埋块，1份用于RNA 质检、切片选片、上透化芯片和表达芯片，另1份用做备份，避免因样本异常等特殊情况需要重新送样而耽误项目周期。
2.4 OCT包埋过程
2.4.1仪器与耗材
1) 所有器械和环境需要消毒灭菌，所有器械（如剪刀、镊子等）需要冰上预冷；
2) 在医用托盘上放一层冰，然后覆盖上一层锡箔纸，再铺几层无菌布，将个体放在无菌布上进行取样，保持整个取样过程在低温中进行，可以延缓核酸的降解，（动物组织建议针对活体或刚死亡个体进行解剖取样）；
3) 动物组织如果取样后无法立即进行后续包埋实验，可以将样本清理干净后，暂时放入组织保护液（美天旎，货号130-100-008）或DPBS或生理盐水中并置于4℃冰箱暂存，暂存时间最长不要超过5h，以免造成RNA降解，RIN值质检不合格；
注：肝组织最好立即包埋，若要暂存需在冰上保存不超过2h，时间过长容易出现核碎裂。
4) 使用指定品牌的OCT（樱花牌-4583）或OCT（leica-FSC 22）进行包埋，OCT使用前在冰上倒置预冷30min。
2.4.2样本采集
1）取下新鲜组织，立即剔除结缔组织和脂肪组织等非研究所需的组织类型，对肿瘤组织的取材，应尽可能准确地判定肿瘤和正常组织，肿瘤组织应将周围的正常组织切除干净（正常组织也应将周围的肿瘤组织切除干净）；
2) 迅速用预冷的PBS溶液（RNase free）或生理盐水将组织表面的残留血液冲洗干净，然后用医用吸水纸或无菌纱布吸净表面液体；
3) 如果组织体积较大，需要将组织切成长宽＜6.5*6.5mm（10x Genomics/6.8*6.8mm（百创S3000）的小块，用7*7*5mm的特小号包埋盒进行包埋；取下的组织应立即进行后续包埋实验。实验室不提供组织冷冻包埋相关试剂，需客户网上自行购买。
2.4.3动物组织速冻包埋
下文提供了2种包埋方法：异戊烷+液氮包埋法、干冰包埋法。异戊烷+液氮包埋法，可以快速降温，保护细胞完整性，但操作较复杂，而且异戊烷对人体有一定的健康危害。干冰包埋法适合更多的组织类型，也可以得到较好的切片结果。故含水量高的，组织需要快速冷冻的样本优先建议使用液氮+异戊烷法其次为干冰法。
2.4.3.1 异戊烷+液氮包埋法
1) 用异戊烷（足以完全浸没组织）填充三分之二的金属烧杯，然后放入液氮杜瓦瓶中（液氮与异戊烷保持相同的水平面）以充分接触，孵育15分钟；
2) 将新鲜组织置于培养皿中，用干净的纱布或者纸巾吸干组织周围血水，尽量使组织表面干燥；
3) 标记包埋盒（样本名称、样本方向、包埋日期等，一定在冷冻之前，对包埋盒做标记，一旦冷冻包埋盒将很难标记信息，重要！）；
4) 将包埋盒转移到冰上，在包埋盒中注入预冷OCT，注入量为包埋盒高度的1/4-1/3，避免产生气泡；
5) 冰上预冷镊子，将组织放入OCT中，调整好方向，用OCT覆盖任何裸露组织的表面，确认没有气泡，尤其是在组织附近，如果有气泡可用移液枪将气泡移除。以免影响组织切片形态结构（此步需要拍照记录，OCT 冷冻后会变白，将很难确定组织的方向）；
6) 用镊子将包埋盒放到异戊烷上，不要使异戊烷浸入包埋盒内，直到组织冻结，冷冻时间可根据组织类型和大小而变化（如下图）；
将OCT包埋的组织块和包埋盒用锡纸包裹好，做好样本标记，直接保存在–80℃的密封容器中，干冰运输。
注：脑组织推荐使用异戊烷+液氮方案进行包埋，肺组织优先石蜡包埋。含水量较高的病理性水肿的组织建议下面的沉糖包埋法
1)配置10%、20%蔗糖，将配置蔗糖溶液进行预冷；
2)配置10%甲醛溶液或4%多聚甲醛固定液，提前4℃预冷；
3)将新鲜组织置于培养皿中，用干净的纱布或者纸巾吸干组织周围血水，尽量使组织表面干燥；
4)将组织放入预冷的固定液中，冰上孵育10min；
5)孵育结束后将组织取出用预冷生理盐水清洗组织，清洗后放于预冷的10%蔗糖溶液中，并放置于冰上孵育，直至组织沉底。若组织直接沉底则转至预冷的20%蔗糖溶液中；
6)将组织从10%蔗糖溶液中取出，转至20%蔗糖溶液中，放置于冰上孵育，直至组织沉底。
7)用异戊烷（足以完全浸没组织）填充三分之二的金属烧杯，然后放入液氮杜瓦瓶中（液氮与异戊烷保持相同的水平面）以充分接触，孵育15分钟；
8)沉底后将组织取出，用预冷的1*PBS或生理盐水冲洗表面多余蔗糖；
9)冲洗干净后用干净的纱布或者纸巾吸干组织周围水份，尽量使组织表面干燥；
10)标记包埋盒（样本名称、样本方向、包埋日期等，一定在冷冻之前，对包埋盒做标记，一旦冷冻包埋盒将很难标记信息）；
11)将包埋盒转移到冰上，在包埋盒中注入预冷OCT，避免产生气泡；
12)冰上预冷镊子，将组织放入OCT中，调整好方向，用OCT覆盖任何裸露组织的表面，确认没有气泡，尤其是在组织附近，如果有气泡可用移液枪将气泡移除。以免影响组织切片形态结构（此步需要拍照记录，OCT冷冻后会变白，将很难确定组织的方向）；
13)用镊子将包埋盒放到异戊烷中，但不要使异戊烷浸入包埋盒内，直到组织冻结，冷冻时间可根据组织类型和大小而变化；
14)将OCT包埋的组织块和包埋盒用锡纸包裹好，做好样本标记，直接保存在–80℃的密封容器中，利用干冰运输。
2.4.3.2 干冰包埋法
无需异戊烷，直接用干冰粒进行包埋。
1) 将新鲜组织置于培养皿中，用干净的纱布或者纸巾吸干组织周围血水，尽量使组织表面干燥；
2) 标记包埋盒（样本名称、样本方向、包埋日期等，一定在冷冻之前，对包埋盒做标记，一旦冷冻包埋盒将很难标记信息，重要！）；
3) 将包埋盒转移到冰上，在包埋盒中注入预冷OCT，注入量为包埋盒高度的1/4-1/3，避免产生气泡；
4) 冰上预冷镊子，将组织放入OCT中，调整好方向，用OCT覆盖任何裸露组织的表面，确认没有气泡，尤其是在组织附近，如果有气泡可用移液枪将气泡移除，以免影响组织切片形态结构（此步需要拍照记录，OCT 冷冻后会变白，将很难确定组织的方向）；
5) 将包含组织和OCT的包埋盒放在干冰粒上轻轻按压（如下图，左），确保水平（否则会影响组织的方向，同时能保证干冰粒与包埋块的接触面积最大以达到快速降温的效果），直到包埋块完全冻结变白（如下图，右）；
6) 将OCT包埋的组织块和包埋盒用锡纸包裹好，做好样本标记，直接保存在–80℃的密封容器中，干冰运输。
2.5样本的保存与运输
包埋后的组织用锡箔纸包住，放入密封袋中密封，放入样本盒在液氮或者-80℃冰箱长期保存，或者放置在干冰上进行冷冻运输，寄送到百迈客实验室，干冰寄送推荐用量约5kg/日。
不规范送样示例：
A. 包埋时组织放置靠近最下层，组织未被 OCT 包裹，导致样本 RNA 降解，质检不合格；
B. 组织暴露在空气中，导致样本降解，组织两侧无 OCT 支撑，展片时可能会破坏样本结构；
C. 组织较小，不满足做表达最小25%的要求；
D. 同一个包埋块包埋了多个样本，但不在同一个平面，并且每一个样本组织过小，覆盖区域有限，可能导致分析有效数据偏低。
2.6切片质控标准
组织形态学检测：对动物组织切片进行 H&E 染色，观察是否获取到目标区域，组织形态完整性是否在可接受范围内（例如是否有大的裂痕，存在明显的空泡、褶皱等）。
RNA 完整性检测：收取 10-15 张切片，利用高通量核酸分析仪(LabChip GX Touch HT)，对样本进行 RNA完整性检测，要求RNA RIN≥6，则认为样本完整性满足实验要求，可以进行后续实验。具体切片质检量如下：
1）10 微米切片厚度，组织占包埋块面积的 1/5-1/4，质检量要求~20 张（左图）；
2）10 微米切片厚度，组织占包埋块面积的＞1/3，质检量要求~15 张（右图）。
注：空间免疫组和ATAC要求RNA RIN≥7，越大越好。
3.其他注意事项
1）测序数据量：10x Genomics 推荐 60G/样，百创 S3000 推荐 250G/样；
2）Xenium关注的重点是组织形态，故对做Xenium的样本中重要的质检是组织形态及 H&E染色，确保组织形态完整无断裂；空间转录组实验默认是通过H&E染色选片开展实验，如有荧光需求请与项目经理或技术联系；
3）在OCT凝固过程中，组织可能会在OCT中出现移位，需要在凝固过程中随时观察组织位置及时调整。
4.风险样本及原因
空间转录组及Xenium技术已经在人类和小鼠的多种类型样本上进行了测试。在人类样本方面，涵盖了乳腺癌、卵巢癌、肝癌、前列腺癌、黑色素瘤、大脑、结肠、扁桃体等。小鼠样本包括胚胎、肺、脑、小肠肾、心脏等组织。高脂肪、高钙化、高致密性、高结缔组织脱片风险较高，继续实验后基因表达得到的基因信息较少(脐带、骨、软骨、滑膜、肌腱、皮肤、胰腺、降解的样本等)；本身细胞少，RNA含量更少的样本(血管组织、角膜组织、有研究本身样本中细胞类群很少的如卵母细胞等)，后续数据分析基本拿不到很多的数据，考虑课题研究价值，可与技术联系进一步沟通是否进行实验。
5.生物安全性声明
我国法定的传染病分为三大类：甲类（一类）传染病包括霍乱和鼠疫；乙类（二类）传染病包括传染性非典肺炎、新型冠状病毒 (2019-nCoV)肺炎、艾滋病、病毒性肝炎、人感染高致病性禽流感、脊髓灰质炎、麻疹、流行性出血热、狂犬病、登革热、流行性乙型肝炎、细菌性和阿米巴性痢疾、肺结核、伤寒和副伤寒、炭疽、流行性脑脊髓膜炎、白喉、百日咳、新生儿破伤风、猩红热、布鲁士病、梅毒、淋病、钩端螺旋体病、血吸虫、疟疾。丙类（三类）传染病包括流行性感冒、流行性腮腺炎、流行性和地方性斑疹、伤寒、风疹、麻风病、急性出血性结膜炎、黑热病、丝虫病、包虫病、还有除了霍乱、细菌、阿米巴性痢疾、伤寒和副伤寒以外的感染性腹泻。
涉及上述传染病的科学研究需符合国家的相关规定，为严格遵守国家法律法规，本着对社会及相关操作人员负责的态度，我司要求客户方真实准确地提供样品的生物安全性信息，对样品是否含有上述感染性病原体进行事先说明。样品中含有上述感染性病原体时，客户方需要提供符合生物安全等级要求的实验室以便开展相关实验，实验进行时，客户方有义务协助我方实验员做好实验安全防护。客户方不得隐瞒样品的生物安全性信息，若出现样品含有感染性病原体而客户事先未告知我司的情况，一经发现我司将停止进行相关项目，已产生的费用由客户方承担。如因客户方提供的生物安全性信息不实、隐瞒样品感染性等有关情况等造成实验员及相关人员被感染、疾病传播等严重后果的，我司将按规定报告国家相关部门，并将通过法律等手段追究相关责任。
6.样品命名规则
样品名称只能包含字母和数字，且只能以字母开头；样品不能出现特殊符号（如♂、♀、^、*、_、#、|、@、！等）和中文及罗马字母，以防止样本名无效；
样本名要唯一；
样本名不能用字母大小写区分，避免使用易混淆的字母和数字；
样本名不能过长或过短，7个字符以内；
组名和样本名不能重复。
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