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1、提取方法

1)植物叶片：（天根 DP441（厂家：天根，型号：DP441）

2)植物根、茎、种子：艾德莱 RN40（厂家：艾德莱，型号：RN40））试剂盒

3)动物常规组织：TRIzol

4)皮肤、毛发：凯捷 217044（厂家：凯捷。型号：217004）

5)全血PAX管送样：PAXgene Blood miRNA Kit(50)（厂家：GENENODE。型号：2145A）试剂盒

6)EDTA抗凝血：TRIzol

2、检测方法

2.1检测方法

使用 Nanodrop2000 （厂家：赛默飞，型号 ：Nanodrop2000）对于提取的核酸进行浓度纯度检测，并使用 LabChip GX（厂家：铂金埃尔默，型号：LabChip GX Touch HT）对完整性进行检测

2.2判定标准

1)总量≥1（ug），满足 2 次建库

2)浓度≥20（ng/ul）

3)体积≥10(ul)

4)OD260/280 在 1.7-2.5 之间，OD260/230 在 0.5-2.5 之间，260nm 吸收峰显示正常

5)RIN值≥8（非植物），RIN值≥7.5（植物），同时若GX检测6.0-6.4的需结合基线判断，28S/18S≥1 且基线无上抬或轻微上抬

6)样本状态正常，样本粘稠、颜色异常、有浑浊或不溶物均不合格

3、建库方法

3.1建库流程

1) 利用带OligodT的反转录引物通过退火与mRNA的polyA尾结合，然后加入RT逆转录酶合成第一链

2)使用含barcode的扩增引物扩增成双链cDNA，并为样品加上barcode

3)使用NEB Next FFPE DNA Repair Mix和NEB Next Ultra II End Repair/dA-Tailing Module完成核酸片段的损伤修复和末端修复加A

4)使用SQK-LSK114试剂盒完成测序接头的连接

3.2建库设备

数字 3*32PCR 仪 厂家 Appliedbiosystems 仪器规格 proflex3*32

制冷型程控五段金属浴 厂家 天根生化 仪器规格 OSE-DB-02

3.3建库试剂盒

1)PCR条形码试剂盒 货号 EXP-PBC096 厂家 Nanopore

2)NEBNext FFPE DNA Repair Mix 货号 M6630L 厂家 NEB

3)NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module 货号 E7546L 厂家 NEB

4)连接测序试剂盒 V14 货号 SQK-LSK114 厂家 Nanopre

4、测序方法

4.1上机操作

1)用测序芯片制备试剂盒配制 Flow cell Priming mix

2)用测序辅助扩展试剂盒配置上机文库

3)用 PromethION Flow Cells 芯片，在PromethION48测序仪运行MinKnow 软件，开始测序，默认运行72 小时

4.2测序设备

PromethION48 测序仪 厂家 Nanopore 仪器规格 PromethION48

4.3测序试剂

测序芯片制备试剂盒 厂家 Nanopore 货号 EXP-FLP004

测序辅助扩展试剂盒 厂家 Naonopore 货号 EXP-AUX003

测序芯片 PromethION Flow Cell(R10.4.1) 厂家 Nanopore 货号 FLO-PRO114M

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