全基因组甲基化测序（wgbs）实验流程材料方法

1、提取方法

1)样本研磨

2)将装有样品的离心管加入1 ml 65 ℃预热的CTAB提取液和2%的巯基乙醇（如 果是动物组织的话加50ul浓度为20mg/ml的蛋白酶K），在涡旋振荡仪上震荡混匀，使样品完全悬浮，65 ℃烘箱温浴40 -60min，不能超过1h

3)温浴期间摇匀2-3次，保证裂解充分。取出后，冷却至室温

4)12000 rpm离心5 min，取上清液900ul至新的2.0 ml 无菌离心管中（。加入等体积三氯甲烷/异戊醇（24:1），上下颠倒混匀， 12000 rpm离心20 min

5)吸取上清液700 ul至新的2.0 ml 无菌离心管，加入等体积三氯甲烷-异戊醇 （24:1），上下颠倒混匀， 12000 rpm离心20 min

6)吸取上清液450 ul至新的1.5 ml无菌离心管中，加入上清液体积的2/3体积（300ul）的异丙醇和1/10体积（45ul）的3M乙酸钠，充分混匀，-20 ℃放置1 h

7)12000rpm离心10min（如果从-20℃取出后絮状沉淀较多，可12000rpm离心20s），弃上清，瞬时离心，用200ul枪头吸弃多余液体

8)向沉淀中加1ml 75%的乙醇溶液，轻弹至沉淀悬浮，12000rpm离心5min，弃上清

9)瞬时离心，用黄枪头吸弃多余液体，离心管开盖室温晾干3-5min至DNA沉淀呈半透明状

10)加入≥20 ul含10 ng/ul RnaseA的超纯水，根据沉淀大小决定融水体积，溶解DNA沉淀，37 ℃水浴锅消化1 h后保存在-20 ℃冰箱备用

注：常规植物组织提取正常使用CTAB提取，疑难植物（蔷薇科等多糖类植物）组织裂解前使用干扰（清洗掉部分多糖等杂质）先清洗，清洗完之后在加裂解液；动物组织在裂解时加入2%的蛋白酶K；宏基因组项目提取在裂解时加入5%-10%的溶菌酶

2、检测方法

2.1检测方法

使用 Qubit（厂家YEASEN, 型号CAT 12642-A ，试剂1XdsDNA HS Assay kit for Qubit ）检测核酸浓度，使用1%的琼脂糖电泳检测完整性

2.2判定标准

浓度≥5ng/ul

总量大于等于 40ng

完整性主带清晰、主带不清晰，轻微拖带在2K以上

核酸状态正常

3、建库方法

3.1基因组打断

1)取适量基因组DNA 至0.6mL进口离心管，混入1%的lambda DNA

2)使用Bioruptor Pico，根据核酸质量情况设置好打断参数，进行超声波打断

3.2打断产物纯化

1)加入适量体积的Vazyme DNA Beads至打断后的DNA中，吹吸混匀，室温静置5min，瞬时离心

2)置于磁力架上，静置5min，移弃上清液

3)加入新鲜配制的80%乙醇，磁力架上静置30s，移弃上清液；连续清洗2次后瞬时离心，用10μL枪头将上清液去除干净

4)离心管置于磁力架上，打开管盖，室温干燥至磁珠表面无光泽，有细微裂纹

5)取下离心管，加入无菌水，吹吸混匀，室温静置，而后磁力架上静置，吸取上清液转入新的 0.2mL PCR 管中

3.3亚硫酸盐转化

1)将CT Conversion Mix平衡至室温并涡旋混匀，于Nuclease-free PCR管中加入CT Conversion Mix和Input DNA

2)涡旋或者吹打混匀后短暂离心，将反应液收集至管底

3)将PCR管置于PCR仪中，设置好程序运行

3.4转化产物纯化

1)将E-Binding Buffer加入至EpiArt DNA Columns (each in a 2 ml Collection Tube)，将转化后的反应产物转移至EpiArt DNA Columns。温和地上下颠倒混匀6 – 8次，使反应产物与E-Binding Buffer完全混匀，离心

2)弃滤液，沿管壁加入100 μl E-Wash Buffer 至EpiArt DNA Columns，离心

3)沿管壁加入E-Desulphonation Buffer至EpiArt DNA Columns，室温(15 ~ 25℃)下静置反应15 min，离心

4)沿管壁加入 E-Wash Buffer至EpiArt DNA Columns，离心

5)重复步骤4，弃滤液，空柱离心将多余的废液离心至管底

6)弃EpiArt DNA Columns，将DNA产物转入新的0.2mLPCR管，产物保存于-30 ~ -15℃，长期保存需放置于-85 ~ -65℃，以防降解

3.5转化产物加接头

1)预热PCR仪：热盖设为105℃，反应温度设置为95℃。在1.5 mL离心管管中配制好后续反应试剂，用移液器轻轻吹打混匀后置于冰上待用

2)将上一步骤转化纯化产物瞬时离心，置于预热的PCR仪上，95℃加热2 min ，迅速置于冰上静置2 min。DNA变性后立即置于冰上，避免已变性为单链的DNA慢慢复性

3)室温解冻3′ Ligation Buffer 、3′ Ligation Enzyme Mix和3’Adapter，上下颠倒混匀后备用

4)在1.5mL离心管中配制如下3’Adapter Ligation预混液（步骤3解冻的试剂）

5)将3′ Adapter Ligation预混液与已变性的DNA用移液器轻轻吹打混匀后短暂离心，将反应液收集至管底

6)将反应管置于PCR仪中，设置好程序运行

3.6单链DNA延伸

1)室温解冻Extension Primer和Extension Enzyme Mix，上下颠倒混匀后备用

2)于上一步骤反应管中加入延伸试剂Extension Primer、Extension Enzyme Mix

3)使用移液器轻轻吹打混匀后瞬时离心，将反应液收集至管底

4)将PCR管置于PCR仪中，按照程序运行

3.7反应产物纯化

1)瞬时离心连接反应管，加入1.2x的Vazyme DNA Beads，轻轻吹吸10次充分混匀

2)室温孵育5min，而后置于磁力架上，静置5min，小心移除上清，避免接触并吸取磁珠

3)保持反应管始终置于磁力架中，用排枪向反应管中加入新鲜配制的80%乙醇，磁力架上静置30s，移弃上清液

4)重复步骤（4）一次，第二次清洗后，瞬时离心，用10μL枪头将上清液去除干净

5)反应管置于磁力架上，打开管盖，空气干燥1-2min，磁珠表面由光亮褐色变为磨砂褐色

6)将反应管从磁力架上取出，加入Dilution Buffer洗脱DNA，吹吸六次混匀，室温静置5min，而后磁力架上静置5min，小心吸取上清至新的PCR管中

3.8 5’端连接接头

1)室温解冻5′ Ligation Mix和5′ Adapter，上下颠倒混匀后备用

2)于上一步骤反应管中配制如解冻后的试剂，使用移液器轻轻吹打混匀后瞬时离心，将反应液收集至管底

3)将PCR管置于PCR仪中，按照程序运行

4)反应产物纯化，同步骤3.7

3.9片段筛选

1)向上述纯化后的PCR管中加入0.5×已混匀的磁珠，吹吸10次混匀，室温孵育5 min；而后置于磁力架上，静置5 min，吸取全部上清液至新的PCR管中

2)加入0.15×已混匀的磁珠，吹吸10次混匀。室温孵育5 min；而后置于磁力架上，静置5 min，移弃上清液

3)加入100 μL新鲜配制的80%乙醇清洗磁珠（不可对着磁珠吹吸），磁力架上静置30s，移弃上清液

4)重复上步骤一次，第二次清洗后用10 μL枪头将上清液彻底去除干净

5)PCR管置于磁力架上，打开管盖，室温干燥1 min；取下PCR管，加入nuclease-free water，吹吸10~15次混匀，室温静置5 min；而后磁力架上静置5 min，吸取上清液转入新的PCR管中

3.10PCR 扩增

1)将VAHTS HiFi Amplification Mix V3和Index Primers*解冻后颠倒混匀，加入上一步骤反应管中

2)混匀，瞬时离心，置于PCR仪中按照程序运

3.11PCR产物纯化

1)瞬时离心连接反应管，补加25ul ddH2O，吹洗混匀后加入0.65 x的Vazyme DNA Beads，轻轻吹吸充分混匀

2)室温孵育5min，而后置于磁力架上，静置5min，小心移除上清，避免接触并吸取磁珠

3)保持反应管始终置于磁力架中，向反应管中加入200μL新鲜配制的80%乙醇，磁力架上静置30s，移弃上清液

4)重复步骤3）一次，第二次清洗后，瞬时离心，用10μL枪头将上清液去除干净

5)反应管置于磁力架上，打开管盖，空气干燥1-2min，磁珠表面由光亮褐色变为磨砂褐色

6)将反应管从磁力架上取出，加入Dilution Buffer洗脱DNA，吹吸六次混匀，室温静置5min，而后磁力架上静置5min，小心吸取上清至新的PCR管中

7)重复上述纯化步骤进行二次纯化。加入0.65 x的Vazyme DNA Beads，轻轻吹吸充分混匀

8)室温孵育5min，而后置于磁力架上，静置5min，小心移除上清，避免接触并吸取磁珠

9)保持反应管始终置于磁力架中，向反应管中加入200μL新鲜配制的80%乙醇，磁力架上静置30s，移弃上清液

10)重复步骤（10）一次，第二次清洗后，瞬时离心，用10μL枪头将上清液去除干净

11)反应管置于磁力架上，打开管盖，空气干燥1-2min，磁珠表面由光亮褐色变为磨砂褐色

12)将反应管从磁力架上取出，加入Dilution Buffer洗脱DNA，吹吸六次混匀，室温静置5min，而后磁力架上静置5min，小心吸取30 μL上清至新的PCR管中

13)分装2ulGX检测

3.12文库质检

1)质检方法：文库通过 Qsep-400进行片段质检， 使用 Qubit 3 .0进行文库浓度的定量

2)质检标准：浓度≥1ng/ul ，峰图在要求切胶范围之内，片段单一无杂峰

3.13建库试剂耗材

1)文库构建试剂盒：EpiArt DNA Enzymatic MethyLation Kit，货号EM301-00；EpiArt DNA Methylartion Library Kit For Illumina V，货号NE103-00

2)产物纯化磁珠：VAHTSTM DNA Clean Beads， 货号N411-03

3)质检使用试剂：Qsep400 标准DNA 卡夹

4)定量使用试剂：Qubit TM dsDNA HS Assay Ki

5)1.5ml离心管、0.2ml PCR管、10ul，200ul枪头：Axygen

3.14建库设备

4、测序方法

测序设备：NovaSeq X plus

测序试剂盒：NovaSeqTMX  Series25B Rgt Kit