small RNA实验流程材料方法

 

1、提取方法

1)植物多组学产品组织细胞：Small RNA提取试剂盒，判定时结合其他产品的总RNA核酸判定

2)植物SRNA产品，艾德莱RN40（厂家：艾德莱，型号：RN40））试剂盒

3)动物（非昆虫）：TRIzol

2、检测方法

2.1检测方法

使用 Nanodrop2000 （厂家：赛默飞,型号： Nanodrop2000）对于提取的核酸进行浓度纯度检测，并使用LabChip GX（厂家：铂金埃尔默，型号：LabChip GX Touch HT）对完整性进行检测

2.2判定标准

2.2.1Small RNA提取试剂盒判定标准

1)总量≥0.4（ug），满足 2 次建库

2)浓度≥20（ng/ul）

3)体积≥10(ul)

4)OD260/280 在 1.7-2.5 之间，OD260/230 在 0.5-2.5 之间，260nm 吸收峰显示正常

5)需结合峰图判断，是否有5s峰，以及其他产品是否有降解

6)样本状态正常，样本粘稠、颜色异常、有浑浊或不溶物均不合格

2.2.2艾德莱RN40、TRIzol

7)总量≥1（ug），满足 2 次建库

8)浓度≥80（ng/ul）

9)体积≥10(ul)

10)OD260/280 在 1.7-2.5 之间，OD260/230 在 0.5-2.5 之间，260nm 吸收峰显示正常

11)RIN 值≥6.0（非植物），RIN 值≥6.0（植物）需结合基线判断，28S/18S≥1 且基线无上抬或轻微上抬

12)样本状态正常，样本粘稠、颜色异常、有浑浊或不溶物均不合格

3、样本状态

样本状态正常，样本粘稠、颜色异常、有浑浊或不溶物均不合格建库方法

3.1连接3’接头

向准备好的RNA中加入3′ Adapter，混匀瞬离后PCR仪70℃加热2min预变性，然后加入RL3 Buffer及RL3 Enzyme Mix，混匀离心后，金属浴孵育进行连接接头反应

3.2反转录引物退火

向上步反应的离心管中加入RT Primer，混匀离心后，放入PCR仪中设定好的程序进行退火反应

3.3连接5’接头

向上步反应的离心管中加入RL5 Adapter（70℃加热2min进行变性后使用）、RL5 Buffer及RL5 Enzyme Mix，混匀离心后，金属浴孵育进行连接接头反应

3.4反转录

向上步反应的离心管中加入RT buffer、RT Enzyme mix，混匀离心后，放入PCR仪中设定好的程序进行反转录反应

3.5PCR 扩增

向上述反应产物中依次加入Amplification Mix、Universal Primer（10μM）和IndexX Primer*（10μM），混匀离心后，放入PCR仪中设定好的程序进行PCR扩增反应。

注意：IndexX Primer*中包含Index序列，使用时需严格按照上机调度安排的序列添加

3.6PCR 产物纯化

1)瞬时离心 PCR 反应管，加入相应体积的磁珠，充分混匀

2)室温孵育，然后置于磁力架上静置，小心移除上清液

3)向反应管中加入新鲜配制的 80% ethanol ，磁力架上静置 30s ，移弃上清液，重复该步骤 1 次

4)打开管盖，磁珠干燥后加入 Nuclease-free Water 洗脱 DNA ，吹吸混匀，室温静置，磁力架上静置，小心 吸取上清至新的离心管中，并分装 1.5 μL 于新的 1.5 mL 离心管中用于片段检测，-20℃保存

3.7PAGE凝胶电泳和切胶

1)向PCR纯化产物中加入10μL 6×Gel Loading dye，轻弹混匀，避免出现气泡

2)取一板6% TBE Gel（1.0mm×10well）胶板放入电泳槽中，倒入TBE缓冲液后，点入marker和样品

3)盖上电泳槽盖，在指定电压下开始电泳，电泳结束后，取出胶放入EB染色液中进行染色

4)染色结束后，在紫外灯下照相保存

5)紫外灯下用刀片切取指定范围的条带，并放入离心管中进行保存

3.8胶回收

1)将胶块在离心机的高速离心力作用下进行破碎，加入1×Elution buffer进行溶胶

2)将溶胶液转入到Spin-X过滤柱中，离心力作用下回收溶胶液

3)向上述溶胶液中加入Linear Acrylamide、3M NaAc及100% Ice cold ethanol，低温沉淀30min

4)将上述沉淀液在离心机下离心，然后用80%乙醇洗涤沉淀

5)用TE buffer溶解沉淀，即为SRNA文库

3.9文库质检

文库通过 Qsep-400 方法进行质检，满足如下指标即可上机检测

3.10建库试剂耗材

1)文库构建试剂盒：VAHTS Small RNA Library Prep Kit for iiiumina v2，货号NR811-02

2)产物纯化磁珠：VAHTSTM DNA Clean Beads，货号N411-03

3)质检使用试剂：Qsep400 标准DNA 卡夹

4)定量使用试剂： Qubit TM dsDNA HS Assay Ki

5)1.5ml离心管、0.2ml PCR管、10ul，200ul枪头：Axygen

3.11建库设备

4、测序方法

测序设备：NovaSeq X plus

测序试剂盒：NovaSeqTM X  Series25B Rgt Kit