机械打断法实验流程材料方法

 

1、提取方法

1)样本研磨

2)将装有样品的离心管加入1 ml 65 ℃预热的CTAB提取液和2%的巯基乙醇（如 果是动物组织的话加50ul浓度为20mg/ml的蛋白酶K），在涡旋振荡仪上震荡混匀，使样品完全悬浮，65 ℃烘箱温浴40 -60min，不能超过1h

3)温浴期间摇匀2-3次，保证裂解充分。取出后，冷却至室温

4)12000 rpm离心5 min，取上清液900ul至新的2.0 ml 无菌离心管中（。加入等体积三氯甲烷/异戊醇（24:1），上下颠倒混匀， 12000 rpm离心20 min

5)吸取上清液700 ul至新的2.0 ml 无菌离心管，加入等体积三氯甲烷-异戊醇 （24:1），上下颠倒混匀， 12000 rpm离心20 min

6)吸取上清液450 ul至新的1.5 ml无菌离心管中，加入上清液体积的2/3体积（300ul）的异丙醇和1/10体积（45ul）的3M乙酸钠，充分混匀，-20 ℃放置1 h

7)12000rpm离心10min（如果从-20℃取出后絮状沉淀较多，可12000rpm离心20s），弃上清，瞬时离心，用200ul枪头吸弃多余液体

8)向沉淀中加1ml 75%的乙醇溶液，轻弹至沉淀悬浮，12000rpm离心5min，弃上清

9)瞬时离心，用黄枪头吸弃多余液体，离心管开盖室温晾干3-5min至DNA沉淀呈半透明状

10)加入≥20 ul含10 ng/ul RnaseA的超纯水，根据沉淀大小决定融水体积，溶解DNA沉淀，37 ℃水浴锅消化1 h后保存在-20 ℃冰箱备用

注：常规植物组织提取正常使用CTAB提取，疑难植物（蔷薇科等多糖类植物）组织裂解前使用干扰（清洗掉部分多糖等杂质）先清洗，清洗完之后在加裂解液；动物组织在裂解时加入2%的蛋白酶K；宏基因组项目提取在裂解时加入5%-10%的溶菌酶

2、检测方法

2.1检测方法

使用 Qubit（厂家YEASEN, 型号CAT 12642-A ，试剂1XdsDNA HS Assay kit for Qubit ）检测核酸浓度，使用1%的琼脂糖电泳检测完整性

2.2判定标准

浓度≥1ng/ul

总量大于等于 30ng

完整性主带清晰、主带不清晰，主要弥散在2K以上，跳带、或严重锯齿状、或“H”形或下方有非常严重的非RNA样弥散等

核酸状态正常

3、建库方法

3.1基因组打断

1)实验前，打开冷却循环组件上的温控开关，温度设置为 4℃ , 使循环水降温至 4℃

2)基因组打断

A.取适量基因组 DNA（Qubit 定量）移入0.6mL进口离心管，用1 ×TE补至总体积60μL（冰上操作）

B.按照对称关系，将0.6mL进口离心管放入0.65mL适配器，旋紧

C.根据片段大小按照相应的打断条件启动打断

3)打断产物的判断

瞬时离心收集打断产物，取 6ul 打断产物电泳，检测在相应片段范围内主产物是否集中

4)打断产物纯化

A.将诺唯赞 DNA clean beads 提前 30min 室温平衡备用

B.将剩余打断产物转入 1.5mL 离心管中，加入（1X）体积已混匀的磁珠，吹吸混匀

C.旋转混匀仪上，室温混匀，瞬时离心，而后置于磁力架上，静置，移弃上清液

D.离心管置于磁力架上，向离心管中加入新鲜配制的 80%乙醇，磁力架上静置 30s ，移弃上清液

E.重复步骤（4）一次，第二次清洗后，瞬时离心，用10 μL枪头将上清液去除干净

F.离心管置于磁力架上，打开管盖，室温干燥至磁珠表面无光泽，有细微裂纹

G.取下离心管，加入0.1 ×TE ，吹吸混匀，室温静置，而后磁力架上静置，吸取上清液转入新的0.2mL PCR管中

3.2末端修复及加A

向上述纯化产物中加入 End Prep Mix 4 ，混匀离心后放入 PCR 仪中进行反应，反应结束后，立即进行 接头连接

3.3接头连接

在上述反应产物中加入 Rapid ligation Buffer 2 、接头和连接酶，放入 PCR 仪中进行接头连接的反应

3.4连接产物片段分选纯化

1)向连接产物中加入一定体积的磁珠，充分混匀，室温孵育后置于磁力架上，静置，小心移除上清

2)向管中加入新鲜配制的 80%乙醇，磁力架上静置 30s ，移弃上清液

3)重复步骤2一次，第二次清洗后，瞬时离心，用10μL枪头将上清液去除干净

4)反应管置于磁力架上，打开管盖，空气干燥，至磁珠表面无光泽，有细微裂纹

5)将反应管从磁力架上取出，加入0. 1×TE洗脱DNA ，吹吸混匀，室温静置孵育，而后磁力架上静 置，小心吸取上清至新的离心管中

6)吸取相应体积 (0.6×)磁珠至步骤5的纯化产物中，轻轻吹吸充分混匀，室温孵育后置于磁力架上， 静置，小心吸取上清液至新的离心管中，取相应体积(0.15×)磁珠至上清液中，轻轻吹吸充分混匀，室温孵 育后置于磁力架上，静置，小心移除上清

7)向反应管中加入新鲜配制的 80%乙醇，磁力架上静置 30s ，移弃上清液，重复该步骤1次

8)打开管盖，空气干燥至磁珠表面无光泽，有细微裂纹，加入0. 1×TE洗脱DNA ，吹吸混匀，室温静置，磁力架上静置，小心吸取上清至新的PCR管中

3.5PCR 扩增

1)加入PCR反应所需的各种试剂，混匀，离心

2)根据 PCR反应条件，放入PCR仪中进行PCR扩增

3.6PCR产物纯化

1)瞬时离心 PCR 反应管，加入相应体积的磁珠，充分混匀

2)室温孵育，然后置于磁力架上静置，小心移除上

3)向反应管中加入新鲜配制的80%乙醇，磁力架上静置30s ，移弃上清液，重复该步骤1次

4)打开管盖，空气干燥至磁珠表面无光泽，有细微裂纹，加入 ddH2O 洗脱DNA ，吹吸混匀，室温静置， 磁力架上静置，小心吸取上清至新的1.5ml的离心管中，- 20℃保存备用

3.7文库质检

1)质检方法：文库通过 Qsep-400进行片段质检， 使用 Qubit 3 .0进行文库浓度的定量

2)质检标准：浓度≥1ng/ul ，质检片段中心值 430-530bp ，平均值 420-580bp 之间，峰型呈正态分布，片段单一无杂峰

3.8引物接头序列

adpter3=”AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC”;

adpter5=”AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT”;

3.9建库试剂耗材

1)文库构建试剂盒：VAHTSTM Universal DNA Library Pren Kit ，货号 ND607-02

2)产物纯化磁珠：VAHTSTM DNA Clean Beads， 货号N411-03

3)质检使用试剂：Qsep400 标准DNA 卡夹

4)定量使用试剂：Qubit TM dsDNA HS Assay Ki

5)1.5ml离心管、0.2ml PCR管、10ul，200ul枪头：Axygen

3.10建库设备

4、测序方法

测序设备：NovaSeq X plus

测序试剂盒：NovaSeqTMX  Series25B Rgt Kit