pcr产物测序送样要求及实验流程材料方法

 

1、检测方法

1.1检测方法

使用 Qubit（厂家YEASEN, 型号CAT 12642-A ，试剂1XdsDNA HS Assay kit for Qubit ）检测核酸浓度，使用1%的琼脂糖电泳检测完整性

1.2判定标准

浓度≥1ng/ul

总量大于等于 30ng

目的条带清晰可见，且片段小于500bp

PCR产物状态正常

2、建库方法

2.1PCR产物纯化和末修

1)PCR产物纯化

使用Vazyme DNA Beads对PCR产物进行1×纯化

2)末端修复加A

向纯化产物中加入End Prep Mix 4和ddH2O，吹吸混匀并瞬时离心，按照下述程序在PCR仪上进行反应

2.2接头连接和纯化

1)向上述末修产物中加入Rapid ligation Buffer 2、Rapid DNA ligase、IDT Adapter X，吹吸混匀后20℃孵育15min（若使用PCR仪则不加热盖）

2)使用Vazyme DNA Beads对接头连接产物进行0.8X纯化

2.3文库质检

1)质检方法：文库通过 Qsep-400进行片段质检， 使用Qubit 3 .0进行文库浓度的定量，使用TIANSeq DNA Quanti Kit 1S (Illumina)进行QPCR定量

2)质检标准：浓度≥1ng/ul，QPCR定量合格

2.4引物接头序列

adpter3=”AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC”;

adpter5=”AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT”;

2.5建库试剂耗材

1)文库构建试剂盒：VAHTSTM Universal DNA Library Prep Kit for illumina 货号ND607

2)产物纯化磁珠：VAHTSTM DNA Clean Beads， 货号N411-03

3)质检使用试剂：Qsep400 标准DNA 卡夹

4)定量使用试剂：Qubit TM dsDNA HS Assay Ki

5)1.5ml离心管、0.2ml PCR管、10ul，200ul枪头：Axygen

2.6建库设备

3、测序方法

测序设备：NovaSeq X plus

测序策略：PE150