无缝克隆试剂盒原理
与传统的双酶切相比，无缝克隆过程不需要利用“内切酶”，而是要借助“外切酶”形成dsDNA的粘性末端，并利用DNA连接酶催化形成磷酸二酯键修复缺口。
【注：内切酶：水解DNA分子链内部磷酸二酯键，生成寡/寡聚核苷酸的酶。外切酶：是在核酸链的末端，按序降解核苷酸的酶，产物是单个的核苷酸。】
Biomarker MultiF Seamless Assembly Mix 作为新一代的无缝克隆试剂，专门针对多片段无缝组装反应进行优化，可以一次实现多至5个插入片段的特定顺序组装克隆，无需特定限制性酶切位点。试剂盒中包含三种酶：T5核酸外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶。
T5核酸外切酶：它能沿着5’→3’方向，降解dsDNA，形成产生黏性末端，便于与另外的同源末端进行配对结合。
DNA聚合酶：相同的黏性末端互补配对之后，再通过DNA聚合酶将缺失的碱基修复。
DNA连接酶：DNA片段完全碱基互补配对完成之后，DNA连接酶进一步催化其形成磷酸二酯键，将所有缺口补齐，实现无痕拼接，形成完整的DNA分子。
值得一提的是，这三种酶都可以在同一个温度（50 ℃）下发挥良好的功能，整个反应过程15 min即可进行转化，完成定向克隆。
图1：Biomarker MultiF Seamless Assembly Mix方法原理图。
产品优点
与传统克隆相比，无缝克隆具有以下优势：
不受载体&酶切位点&片段序列的限制，实现任意组装；
操作简单、快速、高效， 适用于所有载体在任意位点进行定向克隆；
无载体自连现象，克隆阳性率可达 95%以上；
一次实现多至5个插入片段的特定顺序组装克隆。
可组装长达上百kb的DNA片段。
产品应用
快速克隆
高通量克隆
无缝克隆
DNA定点突变。
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