分类: 医学研究, 转录组测序

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英文题目:Comprehensive diagnostics of acute myeloid leukemia by whole transcriptome RNA sequencing

中文题目:全转录组RNA测序对急性髓系白血病的综合诊断

期刊:Leukemia

影响因子:11.528

发表日期:2020.3.3

摘要

急性髓细胞白血病(AML)是由基因变异引起的,基因变异也控制着患者的预后,并指导风险适应和靶向治疗。急性髓系白血病的遗传变异在结构上是多样的,目前通过不同的诊断分析来检测。本研究旨在建立全转录组核糖核酸测序作为AML诊断的单一、全面和灵活的平台。我们开发了HAMLET(人类急性髓细胞白血病快速转录组学)作为生物信息学管道,用于同时检测fusion genes、small variants、tandem duplications和gene expression,所有信息都集中在一个被注释的、简易的输出文件中。对100例急性髓系白血病患者进行了全转录组RNA测序,并通过reference assays和targeted resequencing验证了HAMLET结果。数据显示,HAMLET z确地检测到所有融合基因和过表达EVI1与3q26突变无关。此外,AML中经常突变的13个基因的small variants有99.2%的敏感性和100%的特异性,以及FLT3和KMT2A的tandem duplications以100%的灵敏度和97.1%的特异性通过了新算法检测。总之,HAMLET有潜力成为在单一技术平台上提供与AML分类、风险评估和靶向治疗相关的z确全面的诊断信息的平台。

背景介绍

急性髓系白血病(AML)是由功能互补的基因突变引起的,这些突变导致髓系前体细胞不断增殖和成熟被抑制。显性 AML 平均携带13个非同义突变。造血干细胞中AML起始突变的获得可能比AML诊断早几十年。2016版的WHO classification of hematologic malignancies区分临床和预后重要性的九种AML亚型。在50-55%的AML病例中进行对遗传变异的风险评估的z确分类,并可能指导靶向治疗。在80-85%的AML病例对重复突变基因的扩展组的基因组进行分类。

然而,急性髓细胞白血病的z确分类需要不同的技术来捕获结构多样的基因突变,如较大的插入和缺失(indels)、融合基因和除小变异外的结构性染色体变异。此外,结构正常基因的表达水平可对预后产生决定性影响。因此,在当前的技术平台下,急性髓细胞白血病诊断及风险评估仍然繁琐、贵,且不完整。为了解决这一需求,我们实施了全转录组RNA测序(mRNAseq),作为获取与当前和未来分类和风险分类相关的所有遗传信息的单一平台。在这种诊断范式中,一个经认可的mRNAseq协议获取诊断样本的全面数据。对于单次运行数据分析,我们开发了一个指定的集成生物信息管道(人类急性髓细胞白血病快速转录组学(HALLET);Fig. 1)。HAMLET具有灵活的适应性和个性化,可以查询一组选定基因的序列变异和表达水平,以及易位情况。

实验材料

从莱顿大学医学中心(LUMC)的血液学生物库中选择了100份经机构审查委员会批准获得的冷冻保存的急性髓系白血病样本。所有样本都进行了基因分型NPM1突变和FLT3内部串联复制(FLT3-ITD)由LUMC分子诊断实验室认证。

实验方法

全转录组测序,HAMLET输出的验证

结果

经认证的mRNAseq在100个AML样本上产生了4885万个reads(9700-17000万个reads),平均插入大小为149-177个碱基。质量控制后的平均阅读长度为123–124个碱基。
融合基因检测

HAMLET在24例病例中z确检测到中期细胞遗传学预测的所有复发融合基因(Fig. 2a)。另外3例除t(9;11)(p21;q23)外的11q23易位病例,HAMLET正确识别了KMT2A融合相关基因MLLT1,MLLT4,和MLLT6(图1,2)。此外,HAMLET在8例病例中正确识别了融合转录本,这些转录本不能通过中期核型分析预测,但与急性髓系白血病的预后相关(图2b)。FUS-ERG 检测到融合基因,其对应的t(16;21)(p11;q22)仅在其复杂核型中被鉴定。携带ETV6-LYN融合基因的AML(2-020)的核型为add(8)(q24)和del(12)(p13),但缺乏特征ins(12;8)(p13;q11q21)。三个AML (2-003,2-031,2-032)发现NUP98-NSD1融合转录本。由于两个参与基因的端粒位置NUP98-NSD1源于t(5;11)(q35;p15.5),因此目前未被AML分类,尽管其与不良预后相关。在三个病例(2-053、3-021、3-024)中发现PIM3-SCO2发生了基因融合。此前已在儿童急性髓系白血病中发现,可起源于慢性中性粒细胞白血病的0.6 Mb号染色体倒位。

HAMLET提供了融合转录物的详细信息,包括差异剪接(KMT2A-MLLT3、RUNX1-RUNX1T1、PML-RARA、CBFB-MYH11和NUP98-NSD1)和来自平衡易位的相互转录物,例如,RARA-PML, ERG-FUS, NUP214-DEK, 和 NSD1-NUP98。总之,HAMLET检测到54种不同的融合转录本,这些转录物不能通过中期核型分析预测。总的来说,28例急性髓系白血病携带两个或多个融合,在一个复杂的AML中*多有9个不同的融合基因。

small variants检测

HAMLET的VARSCAN组件在13个AML基因中鉴定出246个小变异体。HAMLET对NPM1和DNMT3A的FLT3-ITD和热点区域进行了敏感性评估,对其余的418个被HAMLET称为野生型的样本进行了靶向重测序反应。VARSCAN只识别了七个相当短的FLT3-34人中的ITDFLT3-ITD携带AML。在这种情况下,HAMLET都正确地识别了一个ASXL1(3-030)的30bp C末端插入和CEBPA (3-003)中一个N端易位。HAMLET检测到的小变异体的总体类型和分布与在COSMIC中报告的分布非常一致。

HAMLET检测的变异在COSMIC中列出并位于定义的遗传热点内,很容易被解释为A类变异(n = 114;46.3%)。COSMIC中报告了60种变异(24.4%),但没有位于热点。这些B类变异大部分在已知突变发生在整个编码序列中的基因中被检测到(CEBPA,TET2,RUNX1,WT1和TP53).其余变异并未报告(C类变异体:n= 52;21.1%)或未在COSMIC中列出但被描述为SNP(D类变异体,n= 20;8.1%).D类变异可能代表真正的低等位基因频率的遗传多态性。C类变异体可以根据其预测的致病作用来解释。按这种规定进行解释,90%以上的A类变异,50%的B类和C类变异体和小于1%的D类变异体是髓系恶性肿瘤的复发突变。

在TCGA AML队列中,基因组DNA中存在的小变体已被证明在相应的RNA序列分析中是不存在的。因此,我们验证了小变异的HAMLET结果RUNX1,TET2,TP53,DNMT3A,KIT1,和IDH1通过靶向NGS对从56例急性髓系白血病分离的基因组DNA。选择这些病例是因为TP53,RUNX1和TET2的遗传特征与基因突变增加的可能性有关,在这56例AML病例中,HAMLET检测到67个变异,包括18个易位,它们是无义介导的RNA衰变的潜在靶点。在这67个变体中,有一个TET2三例急性髓系白血病病例中的变异体(c.4317dup)被目标NGS遗漏。这个A插入发生在6个其他A核苷酸的延伸中,显然很难在Ion GeneStudio S5系统上进行排序。原始数据中存在这种变异的Reads,等位基因频率为2-3%。还有两个变异被目标NGS发现,但被HAMLET错过了。这些变异包括RUNX1是已被靶向NGS检测到的错义变异体,具有10%的低等位基因频率和IDH1。总之,我们的数据显示,HAMLETz确地调用了TET2,TP53,RUNX1,KIT,IDH1和DNMT3A包括由转录物编码的所有变异,这些转录物是无义介导的衰变的潜在目标。我们还确定了HAMLET-RNAseq检测所需的测序深度,并对100个急性髓系白血病进行了20万、30万、40万和4750万个读对的流水线操作。在HAMLET所称的246个变异中,有53个变异是无义突变或移码突变。HAMLET检测这些变异的z确度从100%、96%、85%下降到70%,而其余变异体的z确度从100%、98%、96%下降到81%。这些数据表明,约测5000万个reads的高测序深度对于确保检测所有变异类型是必不可少的。

等位基因的CEBPA突变为核型正常的AML带来了良好的预后并且将一个等位基因上编码序列的第一个357 bp内的N-末端移码突变与c.834-1074之间的C-末端框内插入或缺失相结合,从而破坏另一个等位基因上的DNA结合。通过Illumina平台上通常可获得的reads长度来证明它们在相反染色体上的位置。然而,双等位基因CEBPA突变与特定的基因表达谱有关。基于mRNAseq的基因表达谱显示了特征性的双等位基因CEBPA携带两个样本的所有四个急性髓系白血病样本的突变相关特征CEBPA突变(2-009、2-039、2-045和3-003),包括其C端突变被HAMLET遗漏的病例3-003(图3)。11例急性髓系白血病中,有一例CEBPA变异,一个病例(2-025)的特征性N-末端移码突变与双聚在一起CEBPA变异。因此,将变异检测与基因表达谱结合分析,可以单独解决变异检测的不确定性。由于CEBPA 双突变体的基因标记不是定量的,所以尚未在HAMLET中实施临床应用。

检测中的串联重复FLT3和KMT2A

外显子中常见串联重复的可靠检测FLT3在急性髓系白血病诊断中尤为重要,因为FLT3-ITD是酪氨酸激酶抑制剂治疗的适应症。除了对FLT3-ITD,其位置、大小和突变与等位基因比率对急性髓系白血病的预后有重要影响。为了改善对不充分的检测FLT3-ITD通过VARSCAN,我们开发了ReSCU作为一种新的算法,该算法基于在相互基因位置发生的部分对齐、SC reads的调用。

ReSCU确定了36例有FLT3-ITD,包括由VARSCAN检测到的所有7例small ITD病例和经认证诊断确定的所有34例病例(图4a)。NGS的有针对性的重新排序进一步证实了FLT3-除了两种情况之外,所有情况下,ITD都处于软限幅方法确定的位置(表SXIV).在两个由ReSCU调用但不是由标准诊断调用的不一致案例中,SC reads占其各自位置总覆盖率的小于1%。仔细审查原始数据显示FLT3-在这两种情况下,ITD信号都低于检测阈值,表明HAMLET的灵敏度更高(图S6).突变型与正常型的等位基因比FLT3片段与ReSCU调用的SC reads百分比有很好的相关性(图4b).

KMT2A-PTD外显子2–13,这对于将AML 分类到染色质剪接组,导致蛋白质延长,对AML的临床结果产生不利影响。ReSCU识别的KMT2A-PTD外显子2-8和2-10分别出现在4和2病例中,外显子2、2-3和3-6的重复出现在单个病例中(图4c)。全部九个KMT2A-PTD通过 RT-PCR和测序进行验证。

基因过表达的检测

结构正常基因的过度表达会影响急性髓系白血病患者的预后BAALC, ERG, MN1, DNMT3B, SPARC, and EVI1。mRNAseq测量过表达的可靠性被评估为预示AML预后非常差的EVI1转录本(图5a)。过表达EVI1可由inv(3)(q21q26)或t(3;3)(q21;q26),但是存在替代的分子机制。mRNAseq检测到的EVIl外显子1的表达与定量RT-PCR检测结果有很好的相关性(图5b).两例(1- 005,3 -029)携带inv(3)(q21q26)和1例(1-008)携带t(3;8)(q26;q24)均可见高EVI1表达。在另外4例EVI1高表达的病例中,1例有der(3)t(1;3)(q3?1;q2?5),没有可识别的MECOM1位点参与(病例3-022)。这3例EVIl过表达而无3q26异常的病例均携带KMT2A融合转录本(case 1-001和3-008:KMT2A-MLLT3;case2-047:KMT2A-MLLT4)。这种遗传变异的组合表明AML的预后极差。

Fig. 5 Detection of EVI1 overexpression. a Schematic representation of two mRNA transcripts from the MECOM locus on chromosome 3. One transcript contains exon 1–2 of MDS1 fused to exon 2–15 of EVI1 (MDS1-EVI1 transcript), whereas the other transcript contains exon 1–15 of EVI1 (EVI1 transcript). b Comparison of EVI1 expression by RNAseq and quantitative RT-PCR. Xaxis: Expression of the first exon of EVI1 normalized for expression of the PBGD housekeeping gene by quantitative RT-PCR (log2 EVI1/PBGD). Y-axis: Sum of base coverage of the first exon of EVI1 per kb transcript and one million mapped reads (log2 BPKM) by RNAseq

克隆进化

HAMLET揭示了克隆进化,在诊断和复发时采集的所有四对样本中获得和丢失了遗传变异。尽管基因型明显不同,但IDH2突变作为起始事件的持续存在确立了新生AML和后续治疗相关AML的共同起源(case 3-021、3-038)。因此,一个独立的、与治疗相关的AML的诊断被纠正为原始AML的复发,尽管两个样本将被分类为不同的AML亚型。

急性髓系白血病的分类和预测

根据HAMLET和中期核型分析结果,99例病例可根据世卫组织2016年和基因组分类进行重新分类(图6)。HAMLET信息促进了6个案例的风险重新评估,值得注意的是通过NUP98-NSD1融合而无分类明确病变的AML,或通过EVIl过表达而无inv(3)(q21q26)来分配风险。

 

原文链接

https://international.biocloud.net/zh/article/detail/32127641

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