PCR经验分享 | | 百迈客生物

发布于 2021年11月9日

PCR(Polymerase chain reaction)即聚合酶链式反应，是一种体外扩增基因的技术或获得目的基因片段的方法。在分子生物学实验中已占有及其重要的地位。随着越来越多的基因研究，PCR已走进了实验人的千家万户。请读者跟着小编的步伐，揭开PCR的神秘面纱！

不少初入基因克隆的新手来说，PCR实验结果常常不理想，别急，根据小编的经验，总结了大概有以下几点的原因，或许会帮助屏幕前的你走出误区：

PCR扩增无目的条带

这种结果的出现是所有失败里面出现次数多的情况，比较好的方法就是尝试更换引物，如果不是以下原因出现的话，引物的好坏决定了PCR实验的成败。通常情况下，引物扩增效率高的话，即便温差在5度，都可以获得很理想的结果，且特异扩增。一般选择引物GC含量在40%-60%，碱基数在19-23bp即可。GC含量高，可以减少碱基的数量，含量少，可以增加碱基的数量。

PCR出现非特异扩增

这种情况的出现一般都是引物的特异性较差，或者也有可能是模板浓度太高，致使模板链数量太多，引物极易错误配对，此时可适当稀释模板，应该会有很好的效果，但还有一种极其特殊的情况，就是出现了污染。
常见污染来源：

1：枪杆的污染，这是实验室最常见的污染，由于上次吸液动作剧烈，移液时会把上次污染源带入到实验中，而PCR最容易受到微量液体的污染，导致实验失败。

2：手套等外源核酸酶的污染，以及PCR体系的水一定选择灭菌水。

PCR条带弱

有目的条带，但是浓度低，引物如果没有问题的话，那就是模板讲解的原因。根据实验室经验表明，模板最多不冻融超过两次，四度溶解后保存不能超过一个星期，其实一个星期之内，随着时间的延长，条带会逐渐减弱，七天之后就没有了，所以模板的保存很重要。

巢式PCR（nested PCR）

巢式PCR就是利用PCR扩增的产物当模板，在目的基因片段内再设计一对嵌套引物，作为巢式PCR引物，此时经过几轮PCR后，目的扩增产物的浓度就会很高，但同时也会引入一些碱基突变。适用于基因表达量低的基因克隆或者提高目的片段的浓度，会有不错的效果。

半巢式PCR, 利用一个嵌套引物，而不是一对，原理同巢式PCR相似，都会使目的片段增亮几个级别。

图1 原始PCR产物

图2 半巢式PCR产物

小编在做基因克隆时，如果要对图1PCR产物送去测序，浓度会很低，达不到测序的浓度，当时就利用半巢式PCR, 经过切胶，成功获得了目的片段序列。

产物保存

尽量不要在4度超过一天，DNA很容易降解，保存时间太长的话会对实验结果产生一定的影响，超过两天很有可能就会使条带消失。建议直接胶回收并进行后续实验。

在此，给大家介绍一款百迈客生物公司的 PCR Mix试剂盒–Biomarker HS 2X HF Master Mix，该产品具有以下特点：

高特异性

该试剂盒中的DNA聚合酶添加了能够抑制酶活性的单克隆抗体，可进行高特异性的热启动PCR。

高保真性

该酶是具备高保真度的热稳定DNA聚合酶之一，其保真度比Pyrococcus furiosus DNA聚合酶高6倍。

平末端扩增产物

该酶具和3′-5’和有5′-3’持续合成活性酸外切酶活性，其扩增产物为平末端。

操作简单

该预混液中仅需加入DNA 模板、引物和水即可进行扩增。