分类: 转录组测序

2021年7月,百迈客和浙江大学附属妇产医院合作文章“Lack of MECP2 gene transcription on the duplicated alleles of two related asymptomatic females with Xq28 duplications and opposite X‐chromosome inactivation skewing”发表于期刊Human Mutation(IF:4.878)。其中转录组数据差异及功能分析、外显子测序分析等由百迈客完成,此外百迈客业务还包括单细胞转录组、空间转录组、单细胞ATAC&GEX、单细胞免疫组库等,有兴趣的老师可以联系当地销售。

导读

研究背景:

Xq28重复综合征(MDS)是一种严重的神经发育障碍。症状和体征包括婴儿张力过低、精神运动发育迟缓、严重智力残疾、言语发育不良、进行性痉挛、反复呼吸道感染和男性癫痫发作。MDS是由甲基CpG结合蛋白2基因(MECP2)的重复(或三倍)引起的,其增加转录调节因子MeCP2的表达。如小鼠模型和人类所示,MeCP2蛋白过度表达可能对大脑发育和功能产生有害影响。
最初,MDS被认为只在男性中出现,而大多数重复的女性是无症状携带者。然而,后来的报告显示,20多名MECP2重复的受影响女性存在轻度至严重的临床表型。

X染色体失活(XCI)是X染色体的一种转录沉默机制,由XIST的转录启动。XCI通过募集染色质重塑酶复合物诱导渐进表观沉默。一条X染色体在女性个体中随机失活,但一些女性表现出两条X染色体之一的倾斜失活(shewed XCI)。倾斜的XCI可导致女性X连锁疾病的表型异质性。MECP2是一个受XCI影响的基因,而XCI似乎对Xq28重复女性中的MECP2表达至关重要。

结论:

本文中作者检测了两例无症状女性(母亲和祖母)间质性Xq28重复。AR(androgen receptor)和RP2(retinitis pigmentosa 2)分析表明,两者的XCI都极为倾斜,Xq28重复染色体在母亲体内失活,但在祖母体内被意外激活。有趣的是,通过结合RNA测序和全外显子组测序,作者证实XIST仅在两名女性的Xq28重复染色体中表达,表明Xq28重复染色体不活跃。同时,排除这两名女性,尤其是祖母的主要临床表型,重复X染色体中的MECP2和大多数XCI基因没有转录表达或上调。作者发现,使用RNA测序检测的XCI状态与建立女性MECP2复制的临床表型更相关。这表明,除了DNA甲基化之外,还有其他因素维持XCI状态,一种可能的额外抑制机制发生在非甲基化X染色体的转录水平,抵消了MECP2复制的有害表型效应。

英文题目:Lack of MECP2 gene transcription on the duplicated alleles of two related asymptomatic females with Xq28 duplications and opposite X‐chromosome inactivation skewing.

中文题目:转录组+外显子揭示Xq28重复综合征女性患者无临床症状的原因

期刊:Human Mutation

IF:4.878

发表时间:2021.7.14

作者:Yixi Sun

材料与方法:

材料:具有典型的MECP2重复综合征症状男孩患者(III.2)、其母亲(II.2)、父亲(II.1)、外祖母(I.2)、外祖父(I.1);
Keywords:RNA-seq;WEX;SNP微阵列;

实验结果

一、通过SNP阵列、qRT-PCR和FISH分析,在女性II.2和I.2中发现Xq28染色体内重复

使用SNP微阵列检测I.1、I.2和II.2的变化。在II.2和I.2(图1b)中,在Xq28区域和Xq27.3区域分别显示了437KB的重复和284KB的重复,这表明Xq28和Xq27.3重复是母系遗传的。Xq28区域包含13个在线孟德尔人遗传(OMIM)基因(包括MECP2、IRAK1、L1CAM、NAA10和HCFC1)。通过qRT-PCR以验证结果,在男性I.1中检测到MECP2和IRAK1一个基因剂量的拷贝,而在正常对照女性中检测到两个拷贝,在I.2和II.2中检测到三个拷贝(图1c,d)。对女性I.2和II.2的中期染色体进行FISH分析,发现含有MECP2的探针RP11-119A22仅在Xq28处有信号,这表明Xq28重复是串联的,没有整合到基因组的其他地方(图1e,f)。


图1

二、AR和RP2分析表明,女性I.2和II.2具有极度倾斜的XCI

作者进行了基于PCR的AR和RP2分析,以评估外周血中的XCI模式。使用甲基化敏感的限制性内切酶HpaII,使PCR只扩增非活性X染色体上的等位基因。通过分离分析确定了失活X染色体的起源。

II.2的未消化PCR产物给出了每个标记的两个峰(AR为267/287,RP2为359/381)。HPAII消化产物(图2c和2f)观察到一个代表287个AR(359个RP2)的主峰,这表明失活等位基因遗传自I.2。对I.2的未消化PCR产物的分析给出了两个峰(AR为281/287,RP2为359/374)。通过分析HpaII消化产物(图2b和2e)检测到的主峰(AR为281,RP2为374)与II.2失活产物等位基因中的主峰不同。这些结果表明,在母亲II.2和祖母I.2中发现了XCI的极端倾斜,这与失活X染色体不同(图2)。AR PCR产物的287 bp峰值、II.2中RP2 PCR产物的359 bp峰值以及Xq28重复来自祖母I.2,它们与相同的X染色体相连。然而,该等位基因在AR PCR后峰值为287 bp,RP2 PCR后峰值为359 bp,Xq28重复,在II.2中失活,但在I.2中激活。


图2

三、使用外显子组测序在I.2中未检测到X染色体上没有Xq28重复的其他潜在致病性变体

根据AR和RP2分析的结果,I.2中的MECP2重复应该位于活跃的X染色体上。如果两条X染色体都有缺陷,则具有更有害变体的突变X染色体将完全失活,以避免其不良反应,迫使另一条变得活跃。因此,对于I.2,假设在没有Xq28重复的X染色体上存在额外的更有害的致病性变体,从而迫使Xq28重复变得活跃。

微阵列结果中显示,除了Xq28和Xq27.3重复外,在I.2和II.2中未发现致病性拷贝数变异。为了进一步探索其他变体,作者对女性I.2和II.2的DNA进行外显子组测序,在I.2和II.2中筛选了X染色体上OMIM基因的不同变体,特别是在I.2中没有Xq28重复的X染色体上的变异。结果显示,X染色体上有12个变异,包括一个无义变体和11个错义变体。只有三个基因(NR0B1、DMD和USP9X)与疾病有关,根据ACMG指南,所有变异均不符合“致病性”或“可能致病性”的分类(Richards等人,2015)。没有证据表明这些变体比Xq28复制品更有害。总之,在I.2中未发现可导致继发性倾斜的其他潜在致病性变体。

四、对于II.2和I.2,XIST中的杂合SNP 仅在具有Xq28重复的X染色体中表达,这表明Xq28重复染色体不活跃

为了确定可能导致I.2原发性倾斜的原因,作者对外周血单个核细胞(PMBC)进行了RNA测序;通过外显子组测序,作者在I.2和II.2的XIST区域附近鉴定了8个SNP。对于I.2和II.2,没有发现XIST的所有SNPs存在差异,也没有证据表明这些变体会影响XCI的初始过程。在I.2中,没有Xq28重复的X染色体上没有假定的主要倾斜原因。

作者还使用基于配对RNA-seq和DNA-seq数据的XIST酶的度量来量化XCI的倾斜程度。结果表明,rs144237473(NC_000023.11:g.73846325)(g:0/A:288)的杂合等位基因在II.2的纯合条件下表达,这是母体遗传。类似地,I.2中rs144237473(G:0/A:291)的等位基因表达极度倾斜。作者还通过Sanger测序验证了DNA和cDNA中的SNP(图3a)。对于I.2和II.2,在rs144237473(NC_000023.11:G.73846325)位置检测到G/A变体,但在cDNA水平上仅检测到从I.2遗传的带有“A”的等位基因。XIST作为一种X-非活性特异转录本,仅在非活性X-染色体上表达。II.2的Xq28重复染色体也遗传自I.2。结果显示,每一位女性的非活动X染色体都是与Xq28重复相同的染色体。

图3

五、RNA测序显示两名女性的Xq28重复等位基因上的MECP2和IRAK1没有转录表达

X连锁基因的XCI状态被定义为逃逸、可变逃逸和失活。XCI基因,如MECP2和IRAK1,仅在活跃的X染色体上表达。II.2和I.2中XCI基因(MECP2、IRAK1、TMEM187和TKTL1)的所有SNP表达均处于纯合状态,表明II.2和I.2中的XCI极为倾斜。在Xq28重复区域中,有几个信息可以确定亲本来源的单核苷酸多态性,如MECP2(NC_000023.11:g.154030040)、IRAK1(NC_000023.11:g.154013378等。结果表明,从祖母I.2遗传的等位基因(具有Xq28重复)没有转录表达。同样,在可变的XCI基因HCFC1、NAA10和逃逸的XCI基因RENBP中,母亲从I.2遗传的重复等位基因表达较低。图4 中显示的XCI基因的信息性SNP,发现XCI基因MECP2和IRAK1在Xq28II.2和I.2的重复等位基因在转录中沉默。


图4

图5

通过PMBCs中的RNA-seq,作者比较了两名MECP2重复的女性和两名年龄匹配的对照女性之间的差异表达。然后重点研究了跨基因的基因转录Xq28——II.2和I.2中的重复区域;MECP2和IRAK1基因的表达剂量在II.2和I.2之间无显著差异。另外,还通过RT-qPCR检测了具有Xq28重复的家族成员和年龄匹配的正常人中MECP2和IRAK1的mRNA(图5)。与年龄匹配的男性对照组相比,III.1中MECP2和IRAK1的表达剂量显著升高(平均分别为4.6倍和5.2倍),而与年龄匹配的女性对照组相比,Xq28复制女性I.1和II.1中的剂量没有显著上调。

总结

作者通过对Xq28重复(涉及MECP2)女性(母亲和祖母)进行转录组和全外显子测序。仅从AR和RP2分析判断,I.2应该有相关的临床表型,并且MECP2基因表达上调,但I.2是无症状携带者。作为59岁的女性,I.2可能发生与年龄相关的XCI倾斜。通过AR分析,在55-60岁以上人群的横断面研究中,XCI的倾斜度随着年龄的增长而显著增加,但有趣的是,Swierczek等人通过一种新的XCI分析转录分析,发现老年女性的倾斜度没有增加。甲基化水平和转录水平检测到的XCI状态不一致。

作者的结果相似,通过结合RNA-seq和RT-PCR,发现在非活性X染色体上特异表达的X-非活性特异转录物XIST仅在I.2和II.2的Xq28重复染色体上表达。这表明Xq28重复染色体是不活跃的。另外还发现,两个女性的Xq28重复等位基因上的MECP2和IRAK1(受XCI影响的基因)没有转录表达。这解释了为什么这两名女性,特别是I.2,是无症状携带者。同时,作者推测,除了DNA甲基化之外,其他因素也在维持XCI状态,一种额外的抑制机制可能发生在非甲基化X染色体的转录水平,以抵消MECP2复制的有害表型效应。根据XCI,作者的发现为MECP2重复综合征知识及其在女性中的表型后果增加了新的见解,这对遗传和产前咨询具有重要意义。

原文链接:

https://international.biocloud.net/zh/article/detail/34273908

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