三维基因组相互作用在rs13405728 位点识别出潜在的脂肪细胞代谢相关基因 STON1 和免疫相关基因 FSHR |

发布于 2021年9月23日

文献名称：Three-Dimensional Genome Interactions Identify Potential Adipocyte Metabolism-Associated Gene STON1 and Immune-Correlated Gene FSHR at the rs13405728 Locus in Polycystic Ovary Syndrome

期刊：Front Endocrinol (Lausanne)

发表时间：2021年6月24

原文链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8264658/

背景

rs13405728 被确定为汉族和高加索女性中最普遍的多囊卵巢综合征 (PCOS) 易感位点之一。然而，rs13405728 位点的靶基因和潜在机制仍有待确定。

方法

来自卵巢组织的三维 (3D) 基因组相互作用通过高通染色体构象捕获 (Hi-C) 和捕获 Hi-C 技术进行表征，以识别 rs13405728 基因座的推定目标。对 eQTL、RNA-Seq、DNase-Seq、ChIP-Seq 和单细胞测序进行组合分析，以探索这些靶基因在 PCOS 中的分子作用。应用 PCOS 小鼠来验证表达模式。

结果

在3D 基因组相互作用与表观表达峰中，STON1 和 FSHR 被确定为 rs13405728 基因座的潜在靶标，STON1（P=0.0423）和 FSHR（P=0.0013）在 PCOS 患者中高度表达。STON1 共表达基因与脂肪细胞 (P=0.0001) 中的代谢过程 (P=0.0008) 相关，这在来自脂肪饮食小鼠的脂肪组织 (P<0.0001) 和卵巢 (P=0.0035) 中得到验证。免疫系统过程 (GO:0002376) 富含 FSHR 共表达基因 (P=0.0002) 和 PCOS 患者 (P=0.0002)，CD4 在 PCOS 患者 (P=0.0316) 和 PCOS 样模型 (P =0.0079）。同时，在PCOS患者（P=0.0252）和PCOS模型（P=0.0178）中，FSHR表达与CD4表达呈正相关。此外，雄激素受体（AR）被确定为 STON1 和 FSHR 的共同转录因子，并且与卵巢组织和 PCOS 样小鼠中 STON1（P=0.039）和 FSHR（P=4e-06）的表达呈正相关。

研究内容

1、rs13405728 基因座区域的 Hi-C 图和表观基因组峰

文章探索了卵巢组织的 Hi-C 相互作用并在卵巢组织和 GM12878（作为对照）之间进行了比较 Hi-C 图（图 1A），发现 FOXN2、STON1-GTF2A1L、STON1、GTF2A1L 和 FSHR是 rs13405728 (Chr2:48978158) 基因座的假定目标，在卵巢组织中具有相互作用（图 1B）。
卵巢组织的虚拟 4C 信号用于分析 rs13405728 与靶基因之间的相互作用（图 1C）。对 H3K36me3、H3K4me1、H3K9me3 和 H3K27ac 的 DNase-Seq、ChIP-Seq 和 mRNA 数据进行表征，以鉴定卵巢组织的表观基因组调节。文章在 FOXN2、STON1、STON1-GTF2A1L、GTF2A1L 和 FSHR 中发现了表观基因组峰和表达峰（图 1D）。

图A Chr2:48478159-49478159 区域中卵巢组织和 GM12878 之间的比较 Hi-C 图，标记了 rs13405728 基因座。

图B 来自卵巢组织和 GM12878 的 rs13405728 基因座的相互作用频率和相互作用。

图C Chr2:48478159-49478159 区域中卵巢的虚拟 4C 相互作用。

图D DNase-Seq、ChIP-Seq（H3K36me3、H3K4me1、H3K9me3 和 H3K27ac）和卵巢的 RNA-Seq 峰。显示了参考基因和 rs13405728 基因座。Hi-C 高通量染色体构象捕获。

图1. rs13405728 基因座区域的 Hi-C 图和表观基因组峰

2、rs13405728位点与潜在靶基因的表达分析

为了进一步探索 rs13405728 和靶基因之间的分子模式，文章围绕来自 12 个组织的 rs13405728 基因座区域（+/- 10Mb 区域）进行了 Cis-eQTL 分析（图 2A）。与正常患者相比，文章进一步研究了来自 GEO 数据集的 PCOS 患者的这些基因是否发生了变化。发现 PPP1R21、STON1 和 LHCGR 与 rs13405728 的 SNP 相关。在来自 GSE145461 数据集的 PCOS 中，PCOS 患者中只有 STON1（P = 0.0423）升高，PPP1R21、LHCGR、FOXN2、STON1-GTF2A1L 和 GTF2A1L 不显着（图 2B ）。虽然 LHCGR 被认为是 rs13405728 位点的靶基因，但在 PCOS 患者中没有表达差异。
对卵巢组织的单细胞测序数据进行映射，发现 FSHR 在 Cumulus cell_Ube2c 簇（P = 2.3293e-19）、Granulosa cell_Inhba 簇和 Cumulus cell_Car14 簇中高度表达（图 2C）。这种表达模式在小鼠卵巢组织中得到验证（图 2D）。在患者的卵巢颗粒细胞中，发现 PCOS 患者的 FSHR 表达高于正常患者，GSE114419（P = 0.0232）和 GSE138518（P = 0.0013）数据集（图 2E）。此外，我们对卵巢组织中的 STON1、FSHR 和 rs13405728 SNP 进行了单组织 eQTL 分析（图 2F）。

图A 对来自 12 个组织的 rs13405728 位点区域（+/- 10Mb 区域）周围的潜在靶基因的 Cis-eQTL 分析，显示了颜色条。

图B 来自 GSE145461 数据集的 PCOS 患者和正常患者的基因表达。

图C 来自卵巢单细胞测序数据的卵巢细胞簇中的 Fshr 表达。显示了 14 个集群。

图D C57BL/6 卵巢组织中 Fshr 的 IHC 染色。

图E 来自 GSE114419 和 GSE138518 数据集的 PCOS 患者和正常患者卵巢颗粒细胞的 Fshr 表达。

图F 来自正常卵巢组织的 rs13405728 位点的 STON1 和 FSHR 的单组织 eQTL 分析。PCOS，多囊卵巢综合征；eQTL，表达数量性状基因座。

图2. rs13405728 基因座与潜在靶基因之间的表达分析

3、STON1 与脂肪细胞的代谢过程相关，并在脂肪饮食小鼠的小鼠脂肪和卵巢组织中高度表达

由于 STON1 在 PCOS 中的生物学作用尚不清楚，文章在公共数据集中进行了 STON1 的共表达网络，以分析 STON1 在细胞中的分子功能（图 3A）。GO 生物过程分析表明 STON1 的共表达基因与代谢过程 (GO:0008152, P = 0.0008)、细胞成分组织或生物发生 (P = 0.001) 和定位 (P = 0.007) (图 3B) 相关。PaGenBase 中的富集分析表明，网络的细胞特异性富集在脂肪细胞中（P = 0.0001，图 3C）。
为了进一步探索 STON1 在单细胞模式中的表达，文章对 15 个小鼠组织的汇总数据进行了单细胞转录分析。在生殖腺（Cluster5、Cluster6、Cluster13、Cluster21、Cluster38）和基质细胞（Cluster9）中发现了 STON1（图 3D 和补充图 4A、B）。在 GSE135917 数据集中，皮下脂肪的 STON1 表达与体重指数（BMI，kg/m2）之间的相关趋势在男性和女性之间相反（图 3E）。在 GSE155489 中，PCOS 中 STON1 的表达高于正常对照（补充图 4C，P = 0.0391）。重要的是，在脂肪组织（P < 0.0001）和卵巢组织（P = 0.0035）中，脂肪饮食小鼠中 STON1 的 IHC 染色高于正常饮食小鼠（图 3F、G）。

图A 显示了 STON1、共表达基因和相互作用的共表达网络。

图B STON1 共表达基因的 GO 富集分析。

图C 来自 PaGenBase 的 STON1 共表达基因的细胞特异性分析。

图D 来自小鼠单细胞测序数据的合并小鼠组织中 STON1 的 tSNE 图（Han 等人，2018），STON1 表达以簇标记显示。

图E 来自 GSE135917 数据集的男性和女性 STON1 表达与 BMI 之间的相关性分析。来自脂肪饮食小鼠的脂肪组织和卵巢组织中 STON1 的 IHC 染色 (F) 和染色评分 (G)。GO，基因本体论；tSNE，t-distributed 随机邻居嵌入；BMI，体重指数；IHC，免疫组织化学。

图3. STON1 与脂肪细胞的代谢过程相关，并在来自脂肪饮食小鼠的小鼠脂肪和卵巢组织中高度表达

4、FSHR 与免疫系统过程相关，并与 PCOS 患者和 PCOS 模型中的 CD4 表达呈正相关

为了评估 PCOS 中 FSHR 的分子基础，文章首先进行了 FSHR 的共表达网络（图 4A）。GO富集分析表明，FSHR的共表达基因与生殖过程（GO：0022414，P = 0.0002）和免疫系统过程（GO：0002376，P = 0.0002）有关（图4B）。发现免疫系统过程 (GO:0002376, P = 0.0002) 在 PCOS 和正常患者之间的卵泡液差异表达基因 (DEG) 中富集（图 4C、D）。
据报道，高雄激素表型是 PCOS 的重要分子机制，因此对产前雄激素化 (PNA) 小鼠进行分析，来分析 PCOS 小鼠与正常对照之间的 DEG（图 4E）。CD4 等的高表达在 PCOS 患者（P = 0.0316）和 PCOS 小鼠（P = 0.0079）（图 4F-H）中均被发现。此外，还发现了 FSHR 与 PCOS 患者（图 4I）和 PCOS （猕猴）模型（P = 0.0178，r = 0.8889，图 4J）中的 CD4 表达呈正相关（P = 0.0252，r = 0.6967）。

5、AR 被确定为 STON1 和 FSHR 的共同转录因子，并且与卵巢组织中的 STON1 和 FSHR 表达呈正相关

鉴于 PCOS 患者和 PCOS 模型中 STON1 和 FSHR 的表达增加，文章假设 STON1 和 FSHR 在 PCOS 中的潜在作用，并探讨了 PCOS 的高表达机制。然后在 rs13405728 基因座区域（Chr2：48478159-49478159）和 STON1 和 FSHR 的基因区域（图 5A-C 和补充表 4-6）进行了转录因子（TF）分析。AR 是其中唯一的 TF，发现 AR 和 FOXA1 与 STON1 和 FSHR 的 TF 相同（补充图 5A），STON1 和 FSHR 的进一步 ChIP-Seq 分析显示 AR 在原代组织中的调制峰（图 5D， E)。此外，还发现了AR的表达与正常卵巢组织中STON1（P = 0.039，r = 0.22）和FSHR（P = 4e-06，r = 0.47）的表达呈正相关（图5F）。与正常小鼠相比，睾酮处理和高脂肪饮食小鼠中 Ar、Fshr 和 STON1 的表达升高（补充图 5C），并且它们的表达呈正相关（图 5G）。

rs13405728 基因座区域的前 20 个转录因子 (Chr2: 48478159-49478159) (图A) STON1 (图B) 和 FSHR (图C)，调节潜力 (RP) 代表评估 TF 调节基因的可能性的分数 . Y 轴是 RP 分数，X 轴是不同的因素。X 轴上的点代表相同的因素。来自人体组织雄激素受体程序设计的 STON1 (图D) 和 FSHR (图E) 中 AR 的 ChIP-Seq 峰（GSE56288 和 GSE70079）。GTEx数据集中卵巢组织中AR和STON1、AR和FSHR（图F）表达的相关性分析。(图G) 正常小鼠和高脂肪饮食和睾酮处理小鼠中 Ar、Fshr 和 STON1 的 IHC 染色。AR，雄激素受体；GTEx，基因型-组织表达；H+T、高脂肪饮食和睾酮治疗。

图5. AR 被鉴定为 STON1 和 FSHR 的共同转录因子，并且与卵巢组织中 STON1 和 FSHR 的表达呈正相关

总结

总体而言，文章将 STON1 和 FSHR 确定为 rs13405728 基因座的潜在靶标及其在 PCOS 中脂肪细胞代谢和 CD4 免疫表达过程中的作用。

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