分类: 医学研究

研究背景

microRNA(miRNA)通过抑制靶基因的翻译来调节基因表达。之前的工作已经确定了miRNA在调节血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)活性中的作用。环状RNA(circRNA)是否参与VSMC中miRNA活性的调节尚不清楚。

研究目的

识别与VSMCs富含的miRNA相互作用并调控细胞活性的circRNA。

研究方法和结果

1)公共数据挖掘

已发表人VSMCs RNA-seq数据鉴定所有VSMCs生物学重复中共有的稳健表达的circRNA;

2)RNA-seq

小鼠主动脉的三个生物学重复(RNA提取前去除了内膜和外膜层),鉴定人类和小鼠VSMCs之间保守的circRNA;

3)靶向miRNA分析

对于之前在VSMC具有重要生物学作用的miRNA,至少包含其中2个miRNA的保守结合位点:只有一个circRNA具有miR-145-5p结合位点,在小鼠和人之间是保守的。(小鼠中已被命名为circ_1529,人类中命名为circ_8932,其来源基因为Lrp6,其至少具有7个miR-145-5p结合位点)

4)验证VSMC中富含circ_Lrp6

divergent primer扩增cDNA和gDNA,验证其来源于可变剪接;RNAse R抗性检测;放线菌素D处理抑制转录证实circRNA的稳定性(更长的turn-over时间);qRT-PCR检测各组织中circ_Lrp6表达水平并结合RNA-seq数据进行分析:circ_Lrp6和Lrp6在血管中富集。

5)Circ_Lrp6是miR-145的海绵分子

共定位实验:若二者互作应共定位,原位杂交和核/细胞质分离评估它们在小鼠原代VSMC中的定位,在细胞质中高度富集;

评估circ_Lrp6对miR-145活性影响:构建circ_Lrp6过表达和shRNA载体,双荧光素酶报告基因试验,证实circ_Lrp6对Itgβ8等miR-145各靶基因的作用直接依赖于miR-145与共靶mRNA 3’UTR的结合。

circ_Lrp6与miR-145直接结合:AGO2 IP实验验证二者与AGO2结合(circRNA与miRNA的结合由AGO2介导);RIP实验验证二者之间直接结合;等。

6)circ_Lrp6在VSMC中的生物学作用

LOF和GOF实验:划痕实验等证实circ_Lrp6沉默降低迁移能力和损害细胞增殖,增加了VSMC分化标志物平滑肌肌动蛋白和转运蛋白。rescue实验进一步证实上述发现;

血小板衍生生长因子(PDGF-BB)和转化生长因子(TGF-β)分别处理VSMC,在TGF-β处理的细胞中circ_Lrp6和miR-145表达之间存在负相关。

验证circ_Lrp6和miR-145表达是否随病理改变:缺氧有助于血管疾病的发病机理,缺氧与强烈下调的miR-145相关。

7)Circ_Lrp6与血管疾病

不同病理状况circ_Lrp6和miR-145表达分析:例如动脉粥样硬化血管患者中,miR-145的表达显著降低,但circ_Lrp6没有显著变化,在复杂的病理学中两个ncRNA在基因表达方面解离。

评估circ_Lrp6调节是否可能影响小鼠血管损伤模型中的病理反应,检测了在ApoE-/-小鼠颈动脉狭窄模型中特异性敲低circ_Lrp6的抗增殖作用。

综上,两种ncRNA在小鼠和人类疾病的血管病变中受到不同的调节,并且circ_Lrp6的调节可能影响血管疾病的发展。

 

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