Nanopore全长转录组解析大豆种子衰老机制

图1. 1994年和2015年收获的大豆种子五个胚胎的电泳图

2、 转录本选取
测序结果显示，每个flowcell的测序数据量超过2百万个cDNA分子，约97％的分子被转换为核苷酸序列，共保留了3,559,336个具有barcode的序列。1994H和2015H样本之间的平均reads没有显著差异。1994H或2015H样品中分别比对到参考转录组的reads数量相似（分别为1 649 345和1 819 173）。1994H种子中3409个转录本特异表达，2015H种子中4127个转录本特异表达。参考基因组转录本长度和测序转录本呈正相关。1994H的相关性较弱，特别是对于较长的转录本，表明转录本长度短于预期（图2B）。

图2. 10个样品中11 729个转录本的参考转录本和测序转录本长度比较

3、mRNA降解模式
通过每个碱基的读数，将2211个转录本分成不同的降解模式（图3）。在2015H和1994H样品中，未显示降解迹象的转录本表现出几乎一样的测序深度，在储存期间降解的转录本在2015H样品中具有恒定的测序深度，而在1994H样品中靠近3’末端的测序深度增加（图3B），或者在两个群组中测序深度以不同的速率增加（图3C）。 无论储存时间如何，转录本长度都与降解相关。

图3. 比较2015H和1994H每个位置的转录本reads之间的平均归一化测序深度

      区域A在储存23年后无变质迹象，其中172个转录本小于1200 bp。区域A’包含1149个转录本，大多数（853）转录本小于1200 bp，剩余的转录本长度1200-2500bp。区域B包括114个转录本，在2015H样品中比较完整但是在1994H样品中降解，大多数（108）具有中等长度。区域C在1994H样品中的降解多于2015H样品。长转录本61个，中间转录本38个。无小于1200bp 的转录本。区域D包括最初降解的104个转录本，在23年的储存期间几乎没有变化。64个转录本具有可变剪接模式。在区域A的转录本中，20个GO term显著表达，主要与核糖体功能和翻译有关。区域C中，转录本具有显着的ATP结合term和相关功能的过表达。

图4. 随时间发生的降解与在储存早期发生的降解之间的关系

4、鸟嘌呤核苷酸氧化
来自5’末端的转录本降解可以反映年龄相关的RNA氧化。最容易氧化的碱基，8-oxo-guanosine的丰度与总RNA中鸟苷丰度的比例与1989,1995,1999和2015年收获的大豆种子胚轴的贮藏时间无关（图5）。

图5. 大豆种子胚轴贮藏时间中RNA的氧化

5、 qPCR验证
通过qPCR的方法对区域A（无降解）的三种转录本和区域B的三种转录本（仅在1994H种子组织中显着降解）的完整性进行验证，结果显示：区域A的转录本，在组内cDNA文库中5’和3’扩增的cDNA模板相似，且三个cDNA文库ΔCt值没有差异，样本2015H和1994H之间有较小差异。与完整转录本相反，对于易于降解的转录本，ΔCt值在群组之间显著不同（区域B）。在1994H样品中，5’比3’扩增模板丰度低，产生负ΔCt值，在2015H样品中，两种扩增模板丰富度相似。

图6. 使用qPCR验证转录本降解

讨论

在相隔21年的种子的胚轴中比较mRNA的降解，2015H和1994H分别显示未衰老和增加衰老症状。使用全分子cDNA无打断的测序方法对RNA进行测序。发现一些转录本在两个群组中均有降解，但在1994H种子的组织中观察到更多的损伤。损伤主要由于片段碎裂造成，如电泳图谱的变化，转录本覆盖长度和测序深度所示。几乎没有证据表明转录本丢失或引起了氧化损伤。降解转录本中片段大小的连续分布以及转录本长度和降解之间的正相关支持了通过随机片段化造成mRNA降解的假设，这与氧化事件引起死亡的假设一致。

参考文献：
Fleming M B , Patterson E L , Reeves P A , et al. Exploring the fate of mRNA in aging Seeds: Protection, Destruction, or Slow Decay?[J]. Journal of Experimental Botany, 2018, 69(18):4309-4321.