英文题目：CCR2+ monocytes promote memory CD8+ T-cell differentiation via membrane-bound TGF-β
研究单位：西安交通大学基础医学院院长张保军教授团队
期刊名：cellular & molecular immunology
影响因子：21.8
样本类型：8-12周龄小鼠
文章采用技术：空间转录组测序、单细胞RNA测序（scRNA-seq）
引言
在对抗感染和肿瘤的免疫战场上，记忆 CD8+ T 细胞是守护机体的「长效卫士」， 它们能快速识别再次入侵的病原体或癌细胞，发动强力攻击。长久以来，树突状细胞（DC）被认为是主导记忆 T 细胞分化的核心「指挥官」。研究人员通过整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录（BMKMANU S1000）技术，揭示了单核细胞才是调控记忆 CD8+ T 细胞分化的关键「操盘手」，其奥秘藏在「细胞接触」与「分子信号」的双重机制中。其中BMKMANU S1000空间转录组学平台大放异彩，成为揭CCR2+单核细胞促进记忆CD8+ T细胞分化的关键工具。
研究背景
CD8+ T细胞在适应性免疫中扮演着关键角色，能够保护机体免受病原体感染和消除恶性细胞。当CD8+ T细胞识别到抗原后，会迅速增殖并分化为效应CD8+ T细胞和记忆CD8+ T细胞。效应CD8+ T细胞负责即时清除感染，而记忆CD8+ T细胞则提供长期保护，能够在再次遇到相同抗原时迅速启动免疫反应。然而，单核细胞（monocytes）作为重要的髓系免疫细胞，虽在炎症迁移中作用明确，但其是否直接参与T细胞分化尚无定论。
研究策略
动物模型与样本制备
实验动物：优先选择8-12周龄的CD45.1+/CD45.2+及OT-I转基因小鼠
样本制备：脾脏单细胞悬液通过机械分离和红细胞裂解（ACK缓冲液）制备
技术手段
- 流式细胞术分析
细胞分选：从感染LM-WT的小鼠脾脏中分选出cDCs、moDCs和单核细胞等抗原呈递细胞（APCs）
细胞刺激与培养：将分选出的APCs与OVA肽段体外共孵育后，过继转移到已接受初始OT-I+ CD8+ T细胞的WT受体小鼠体内，或与体外刺激的初始CD8+ T细胞共培养
表型检测：通过流式细胞术检测CD8+ T细胞的分化表型，包括记忆相关标记物（如cKit、Sca1、Bcl6、TCF1和Eomes）的表达
- 空间分辨转录组学
样本处理：对感染第0天和第5天的小鼠脾脏组织进行切片，并进行H&E染色以确定组织形态学特征
空间转录组学分析：利用BMKMANU S1000空间转录组学技术对脾脏切片进行分析，揭示不同免疫细胞亚群在脾脏中的空间分布
数据整合：将scRNA-seq数据与空间转录组学数据进行整合，通过Seurat等工具的FindTransferAnchors和TransferData函数，将scRNA-seq中识别的细胞类型映射到空间转录组学数据中，实现细胞类型的空间定位
- 免疫荧光染色
样本处理：对感染第0天和第5天的小鼠脾脏组织进行切片，并进行免疫荧光染色
抗体选择：使用特异性抗体标记CD8+ T细胞、单核细胞（CCR2+）、树突状细胞（CD11c+）等关键细胞类型
结果分析：通过显微镜观察并拍摄染色切片，分析不同细胞类型在脾脏中的共定位关系
- 生物信息学分析
差异基因分析：利用Wilcoxon秩和检验等统计方法，识别不同细胞亚群间的差异表达基因
通路富集分析：通过ClusterProfiler等工具对差异表达基因进行通路富集分析，揭示潜在的生物学过程
伪时间分析：利用Monocle3等工具构建细胞分化轨迹的伪时间轴，分析CD8+ T细胞亚群在分化过程中的基因表达变化
研究结果
研究结果一：通过空间分辨转录组学绘制急性感染后脾组织的图谱
为了研究免疫反应过程中不同免疫细胞的空间分布和CD8+ T细胞分化的调节机制，研究人员通过整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）和BMKMANU S1000空间转录组（ST）技术，分析了急性感染模型中脾脏免疫细胞的空间分布与CD8⁺ T细胞分化机制。实验采用OT-I转基因小鼠模型，通过李斯特菌（LM-OVA）感染诱导免疫反应，关键发现包括：1）脾脏形成7个功能集群（B细胞、T细胞、单核/巨噬细胞等）；2）感染后T/B细胞区扩大，APCs（B细胞、DC、巨噬细胞）在T细胞区外围聚集；3）空间重组与T细胞分化（MP/TE亚群）显著相关。多组学整合揭示了免疫微环境的动态调控机制，为理解感染中细胞互作提供了多组学视角。
研究结果二：急性感染期间效应和memoryCD8 T细胞分化轨迹不同
为了探索CD8+ T细胞分化的空间决定因素，特别是与近端细胞的相互作用，对于急性感染模型研究人员进行了亚群分析、分化路径分析和功能验证，结果表明在急性感染中，IFN反应型CD8+ T细胞和CD8+MP 细胞之间分化轨迹的不同意味着，效应和记忆CD8+ T细胞的命运决定于免疫反应的初始阶段，而IFN应答和MP CD8+ T细胞分别是效应和记忆CD8+ T细胞分化途径的初始阶段。
研究结果三：跨组织区域细胞亚群的鉴定和空间图谱
为了研究脾脏免疫细胞在感染前后的动态变化，研究人员通过整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）和BMKMANU S1000空间转录组（ST）技术，进一步鉴定了供体和受体脾脏中的免疫细胞群。结果显示：①细胞组成：从1.6万细胞中鉴定出19类，包括CD8⁺ T细胞亚群（如记忆前体和IFN反应性细胞）及髓系细胞。②动态变化：感染后第5天，T细胞区从以初始CD8+ T细胞为主转为记忆前体和效应细胞主导，且单核细胞取代DC成为主要浸润的髓系细胞。③功能提示：不同的APC和CD8+ T细胞之间的相互作用在免疫反应和CD8+ T细胞的分化中起着重要作用。
研究结果四：单核细胞和CD8+ MP细胞的抗原依赖性共定位
为了探索不同细胞类型之间潜在的细胞相互作用，研究人员通过评估特异性免疫细胞标记物的表达、免疫荧光染色及空间转录组分析，检查了第0天和第5天脾脏中CD8+ T细胞和单核细胞的空间分布。结果显示单核细胞和CD8+ MP细胞以抗原刺激依赖性的方式在空间上共定位，表明单核细胞可能对CD8+ MP细胞的分化有关键影响。
研究总结
CD8+T 细胞是适应性免疫的重要执行者；特别是记忆CD8+ T细胞对强效和长期保护至关重要。CD8+ T细胞分化在转录水平上的调控机制已被广泛研究。然而，人们对感染过程中效应和记忆CD8+ T细胞分化的空间要求仍然知之甚少。研究人员通过整合BMKMANU S1000空间转录组（ST）技术和scRNA-seq技术，发现了记忆CD8+ T细胞分化的新机制，该机制涉及单核细胞和CD8+ MP细胞之间的解剖学邻近性和TGF-β信号传导。该研究结果阐述了记忆CD8+ T细胞命运决定的新机制，并强调单核细胞作为关键的APC群体，通过细胞间接触依赖的方式在感染过程中促进记忆CD8+ T细胞的分化。
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