空间转录组样本制备要求

1、前言

1.1 适用范围

本指南介绍百迈客实验平台空间转录组产品的送样要求及制备方法，采集送样前请详细阅读。

1.2 声明

我国法定的传染病分为三大类：甲类（一类）传染病包括霍乱和鼠疫；乙类（二类）传染病包括传染性非典肺炎、新型冠状病毒 (2019-nCoV)肺炎、艾滋病、病毒性肝炎、人感染高致病性禽流感、脊髓灰质炎、麻疹、流行性出血热、狂犬病、登革热、流行性乙型肝炎、细菌性和阿米巴性痢疾、肺结核、伤寒和副伤寒、炭疽、流行性脑脊髓膜炎、白喉、百日咳、新生儿破伤风、猩红热、布鲁士病、梅毒、淋病、钩端螺旋体病、血吸虫、疟疾。丙类（三类）传染病包括流行性感冒、流行性腮腺炎、流行性和地方性斑疹、伤寒、风疹、麻风病、急性出血性结膜炎、黑热病、丝虫病、包虫病、还有除了霍乱、细菌、阿米巴性痢疾、伤寒和副伤寒以外的感染性腹泻。

涉及上述传染病的科学研究需符合国家的相关规定，为严格遵守国家法律法规，本着对社会及相关操作人员负责的态度，我司要求客户方真实准确地提供样品的生物安全性信息，对样品是否含有上述感染性病原体进行事先说明。样品中含有上述感染性病原体时，客户方需要提供符合生物安全等级要求的实验室以便开展相关实验，实验进行时，客户方有义务协助我方实验员做好实验安全防护。客户方不得隐瞒样品的生物安全性信息，若出现样品含有感染性病原体而客户事先未告知我司的情况，一经发现我司将停止进行相关项目，已产生的费用由客户方承担。如因客户方提供的生物安全性信息不实、隐瞒样品感染性等有关情况等造成实验员及相关人员被感染、疾病传播等严重后果的，我司将按规定报告国家相关部门，并将通过法律等手段追究相关责任。

2、项目流程

目前百迈客空间转录组测序服务模式默认为组织寄送模式，如果有特殊情况需要上门服务，请与百迈客技术人员确认实验室仪器设备情况。

组织寄送前请至少提前1周进行预约，百迈客接收到样本并确认样本无异常后，3-5天内安排RNA质检并反馈质检结果，质检合格后安排切片、组织结构确认与透化。

3、新鲜冷冻样本

3.1 样本要求

10x空间转录组每块组织样本长宽不宜超过6.5*6.5mm，百创S3000空间转录组每块组织样本长宽不宜超过6.8*6.8mm，厚度＞1.5mm，S2000A空间转录组每块组织样本长宽不宜超过11*11mm，组织截面覆盖小于25%的组织，建议多个包埋成一个OCT包埋块，组织间隔尽量小，但是不要重叠，多个组织保持在一个水平面充分利用捕获区域。

注1：在样本量足够的情况下，每个动物样本最好准备至少2个包埋块，1份用于RNA质检（切片质控标准见第3部分）、切片选片、上透化芯片和表达芯片，另1份用做备份，避免因样本异常等特殊情况需要重新送样而耽误项目周期。

注2：在样本量足够的情况下，每个植物样本最好准备至少3个包埋块，因植物组织目的结构较薄，实验建议进行全流程方案进行空间实验，即一个包埋块在一次切片实验中完成结构确认，贴片表达，贴片透化，避免反复切片导致结构损失，其余2块用做备份，避免因样本异常等特殊情况需要重新送样而耽误项目周期。

3.2 样本采集与运输

3.2.1 采集前准备

1. 所有器械和环境需要消毒灭菌，所有器械（如剪刀、镊子等）需要冰上预冷；
2. 在医用托盘上放一层冰，然后覆盖上一层锡箔纸，再铺几层无菌布，将个体放在无菌布上进行取样，保持整个取样过程在低温中进行，可以延缓核酸的降解，（动物组织建议针对活体或刚死亡个体进行解剖取样）；
3. 动物组织如果取样后无法立即进行后续包埋实验，可以将样本清理干净后，暂时放入组织保护液（美天旎，货号130-100-008）或DPBS或生理盐水中并置于4℃冰箱暂存，暂存时间最长不要超过5h，以免造成RNA降解，RIN值质检不合格；
4. 使用指定品牌的OCT（樱花牌-4583）或OCT（leica-FSC 22）进行包埋，OCT使用前在冰上预冷30分钟。

3.2.2 动物样本采集

1. 取下新鲜组织，立即剔除结缔组织和脂肪组织等非研究所需的组织类型，对肿瘤组织的取材，应尽可能准确地判定肿瘤和正常组织，肿瘤组织应将周围的正常组织切除干净（正常组织也应将周围的肿瘤组织切除干净）；
2. 迅速用预冷的 PBS溶液（RNase free）或生理盐水将组织表面的残留血液冲洗干净，然后用无菌纱布吸净表面液体；
3. 如果组织体积较大，需要将组织切成长宽＜5*6.5mm（10x Genomics）/6.8*6.8mm（百创S3000）的小块，用7*7*5mm的特小号包埋盒进行包埋；取下的组织应立即进行后续包埋实验。

注：原则上实验室不提供组织冷冻包埋相关试剂，需客户网上自行购买，如有需要请联系运营确认实验室是否有存货，因 OCT 试剂无法分装运送，实验室也仅仅可提供包埋盒。

3.2.3 植物样本采集

1. 培养基培养样本：在无菌超净台中取出组织，去除组织表面附着的培养基，用超纯水将组织表面清洗干净。从活体植株上取下新鲜目标区域组织置于培养皿中，利用4℃预冷的镊子和剪刀将目标区域外的组织结构尽量去除，若组织内部存在空腔尽可能修剪组织暴露空腔，之后将组织裁剪成＜5*6.5mm（10x Genomics）/6.8*6.8mm（百创S3000）的小块；
2. 土壤培养样本：将组织从培养土中完整取出，去除土壤及杂质，用超纯水将组织表面土壤及杂质彻底清洗干净。从活体植株上取下新鲜目标区域组织置于培养皿中，利用4℃预冷的镊子和剪刀将目标区域外的组织结构尽量去除，若组织内部存在空腔尽可能修剪组织暴露空腔，之后将组织裁剪成＜5*6.5mm（10x Genomics）/6.8*6.8mm（百创S3000）的小块；
3. 将目标组织按照不同组织类型包埋方法进行包埋

注：原则上实验室不提供组织冷冻包埋相关试剂，需客户网上自行购买，如有需要请联系运营确认实验室是否有存货，因 OCT 试剂无法分装运送，实验室也仅仅可提供包埋盒。

3.2.4 动物组织速冻包埋

下文提供了2种包埋方法：干冰包埋法、异戊烷+液氮包埋法，客户可根据实验条件进行选择。干冰包埋法适合更多的组织类型，是最常用的包埋方法，也可以得到较好的切片结果；异戊烷+液氮包埋法，可以快速降温，保护细胞完整性，但操作较复杂，而且异戊烷对人体有一定的健康危害，一些较小、较轻的样本如穿刺样本推荐使用液氮+异戊烷的方法进行冷冻包埋。

方法1干冰包埋法（常用）

无需异戊烷，直接用干冰粒进行包埋。

1. 将新鲜组织置于培养皿中，用干净的纱布或者纸巾吸干组织周围血水，尽量使组织表面干燥；
2. 标记包埋盒（样本名称、样本方向、包埋日期等，一定在冷冻之前，对包埋盒做标记，一旦冷冻包埋盒将很难标记信息）；
3. 将包埋盒转移到冰上，在包埋盒中注入预冷OCT，注入量为包埋盒高度的1/4-1/3，避免产生气泡；
4. 冰上预冷镊子，将组织放入OCT中，调整好方向，用OCT覆盖任何裸露组织的表面，确认没有气泡，尤其是在组织附近，如果有气泡可用移液枪将气泡移除，以免影响组织切片形态结构（此步需要拍照记录，OCT冷冻后会变白，将很难确定组织的方向）；
5. 将包含组织和OCT的包埋盒放在干冰粒上轻轻按压（如下图，左），确保水平（否则会影响组织的方向，同时能保证干冰粒与包埋块的接触面积最大以达到快速降温的效果），直到包埋块完全冻结变白（如下图，右）。
6. 将 OCT 包埋的组织块和包埋盒用锡纸包裹好，做好样本标记，直接保存在–80℃的密封容器中，利用干冰运输。

方法2 异戊烷+液氮包埋法

脑组织等容易形成冰晶或者水肿病变组织推荐使用此方案进行包埋。

1. 用异戊烷（足以完全浸没组织）填充三分之二的金属烧杯，然后放入液氮杜瓦瓶中（液氮与异戊烷保持相同的水平面）以充分接触，孵育15分钟；
2. 将新鲜组织置于培养皿中，用干净的纱布或者纸巾吸干组织周围血水，尽量使组织表面干燥；
3. 标记包埋盒（样本名称、样本方向、包埋日期等，一定在冷冻之前，对包埋盒做标记，一旦冷冻包埋盒将很难标记信息）；
4. 将包埋盒转移到冰上，在包埋盒中注入预冷OCT，注入量为包埋盒高度的1/4-1/3，避免产生气泡；
5. 冰上预冷镊子，将组织放入OCT中，调整好方向，用OCT覆盖任何裸露组织的表面，确认没有气泡，尤其是在组织附近，如果有气泡可用移液枪将气泡移除。以免影响组织切片形态结构（此步需要拍照记录，OCT冷冻后会变白，将很难确定组织的方向）；
6. 用镊子将包埋盒放到异戊烷上，不要使异戊烷浸入包埋盒内，直到组织冻结，冷冻时间可根据组织类型和大小而变化（如下图）；
7. 将 OCT 包埋的组织块和包埋盒用锡纸包裹好，做好样本标记，直接保存在–80℃的密封容器中 ，利用干冰运输。

3.2.5 植物组织速冻包埋

下文提供了 3 种包埋方法，根据植物组织的部位不同，我们推荐了不同的包埋方式：

方法一 ：抽真空+干冰冷冻OCT包埋（不需要固定）

1）按照2.3植物采样方法裁取样本，空隙较多组织（花苞、茎尖）需将组织部分切开，目标区域外组织需尽可能全部去除。

2）将植物组织浸泡在1ml 05%吐温20中,室温15min。

3）冰上预冷75% OCT包埋剂溶液（5mlOCT+2.5ml灭菌水颠倒混匀），1.5ml离心管中加入1ml 75%OCT，将植物组织浸润在其中，将平底的无吸附膜的吸附柱放入1.5ml离心管中，以防止抽真空过程组织上浮在OCT表面，打开所有管盖，置于真空浓缩仪中（注意配平）。室温抽真空10min，摸索设置成V-AQ，促进OCT溶液充分包裹和进入组织空隙中，保证OCT填充包埋组织的完整性。如下图：

4）将包埋盒放置在冰上 ，标记包埋盒（组织放置的方向 、样品名称等）（可拍照记录），在包埋盒底部加入适量的OCT包埋剂，约1/4深度 ，防止组织沉底直接接触包埋盒底部 。

5）在冰上用镊子轻轻夹住组织，轻轻擦拭表面的OCT，缓慢放入预冷的含OCT的包埋盒中 ，加预冷的OCT直至完全包裹组织，并调整组织在OCT中的位置 ，保证目标平面与切面水平一致，如果多个组织包埋在一起时一定要将组织放置于包埋盒的中部排列整齐 ，避免重叠在一起，此过程中避免产生气泡，如有气泡产生用用针尖轻缓挑出气泡或用200 µl枪头吸出气泡。

6）将包含组织和OCT的包埋盒放在干冰粒上轻轻按压（如下图，左），确保水平（否则会影响组织的方向，同时能保证干冰粒与包埋块的接触面积最大以达到快速降温的效果），直到包埋块完全冻结变白（如下图，右）。

7）将 OCT 包埋的组织块和包埋盒用锡纸包裹好，做好样本标记，直接保存在–80℃的密封容器中，利用干冰运输。

方法二 ：直接冷冻OCT包埋（无需抽真空）

1. 按照2.3植物采样方法裁取样本
2. 将植物组织浸泡在1ml 05%吐温20中,室温15min。
3. 将包埋盒放置在冰上 ，标记包埋盒（组织放置的方向 、样品名称等）（可拍照记录），在包埋盒底部加入适量的OCT包埋剂，约1/4深度 ，防止组织沉底直接接触包埋盒底部 。
4. 在冰上用镊子轻轻夹住组织 ，缓慢放入预冷的OCT包埋剂中 ，直至OCT完全包裹组织。
5. 调整组织在OCT中的位置，尽量将组织放置于包埋盒的中部，保证目标平面与切面水平一致。如果多个组织包埋在一起时一定要将组织放置于包埋盒的中部排列整齐 ，避免重叠在一起 ， 此过程中避免产生气泡，如有气泡产生用用针尖轻缓挑出气泡或用200 µl枪头吸出气泡。
6. 用异戊烷（足以完全浸没组织）填充三分之二的金属烧杯，然后放入液氮杜瓦瓶中 （液氮与异戊烷保持相同的水平面）以充分接触，孵育5- 10分钟，时间不宜太久，防止异戊烷凝结 。（若无异戊烷及液氮可使用干冰包埋）
7. 用镊子夹住包埋盒置于预冷的液氮-异戊烷浴上（避免模具被异戊烷浸没）或干冰上，然后等待OCT凝固变白。
8. 将 OCT 包埋的组织块或者包埋盒用锡纸包裹好，直接保存在–80℃的密封容器中 ，做好样本标记，利用干冰运输。

方法三 ：石蜡包埋

石蜡包埋请使用百迈客专用试剂盒(试用装)，此试剂盒适用于主根、茎、幼果（含水量大）等组织类型，OCT切片破碎的组织也可以使用此试剂盒尝试包埋切片。

详细操作步骤请查看试剂盒说明书（此试剂盒目前为试用装，未正式发布，有需求可沟通销售）

3.2.6 样本寄送运输

包埋后的组织用锡箔纸包住，放入密封袋中密封，放入样本盒在液氮或者-80℃冰箱长期保存，或者放置在干冰上进行冷冻运输，寄送到百迈客实验室，干冰寄送推荐用量约5kg/日。

不规范送样示例：

A.包埋时组织放置靠近最下层，组织未被OCT包裹，导致样本RNA降解，质检不合格；

B.组织暴露在空气中，导致样本降解，组织两侧无OCT支撑，展片时可能会破坏样本结构；

C.组织较小，不满足做表达最小25%的要求；

D.同一个包埋块包埋了多个样本，但不在同一个平面，并且每一个样本组织过小，覆盖区域有限，可能导致分析有效数据偏低。

3.3 切片质控标准

• 组织形态学检测：对动物组织切片进行H&E染色，对植物组织切片进行甲苯胺蓝染色，观察是否获取到目标区域，组织形态完整性是否在可接受范围内（例如是否有大的裂痕，存在明显的空泡、褶皱等）。
• RNA完整性检测：收取10-15张切片，利用Agilent2100对样本进行RNA完整性检测，要求RNARIN≥6，则认为样本完整性满足实验要求，可以进行后续实验。具体切片质检量如下：

1）10微米切片厚度，组织占包埋块面积的1/5-1/4，质检量要求~20张（左图）；

2）10微米切片厚度，组织占包埋块面积的＞1/3，质检量要求~15张（右图）。

3.4 测序数据量推荐

测序数据量：10x Genomics推荐60G/样，百创S3000推荐250G/样；

测序平台：SURFSeq 5000