动物细胞图谱分析绘制方法：单细胞转录组测序技术

长久以来，生命科学的研究主要基于群体细胞水平的分析，随着单细胞组学技术的出现，使我们能够从单个细胞水平，以前所有未的分辨率去解析其他组学掩盖掉的细胞异质性难题和低丰度表达的分子等信息。如今，越来越多从事动物领域研究的科研工作者，开始利用单细胞测序技术来进行动物细胞图谱、生长发育、再生机制、神经科学、生物进化、免疫感染等方面的研究。

本次我们给大家带来两篇利用单细胞转录组技术助力动物细胞图谱绘制的高分文章解读，希望能给老师后续的研究提供思路。

动物细胞图谱分析绘制案例：黑腹果蝇

中文标题：果蝇细胞图谱：成年果蝇的单核转录组图谱

英文标题：Fly Cell Atlas: A single-nucleus transcriptomic atlas of the adult fruit fly

期刊：Science[IF: 63.714] 2022.3.4

DOI：10.1126/science.abk2432

实验设计

实验材料：黑腹果蝇

实验方法：解剖了来自雌性和雄性黑腹果蝇的12个组织（触角、体壁、脂肪体、平衡棒、心脏、肠道、腿、马氏管、绛色细胞、喙和下颚须、气管、翅膀）以及3个性别特异性组织（雄性生殖腺、睾丸、卵巢）。对于遍布全身的组织使用特异性GAL4驱动核-GFP蛋白，再用流式细胞荧光分选技术标记和收集细胞核，进行单细胞核snRNA-seq

测序策略：单细胞核转录组10x Genomics、Smart-seq2

研究内容

黑腹果蝇在生物学研究方面有着丰富的历史，以往研究探索了其不同组织中的表达模式，但缺乏细胞类型分辨率级别的数据库。近年来单细胞技术的进步使得同时对数千个细胞进行转录组分析成为可能，促进了全组织细胞图谱的创建。然而，现有scRNA-seq数据集来自不同实验室，是基于不同遗传背景，不同分离方法以及不同测序平台产生的，阻碍了跨细胞和组织的基因表达的系统性分析。

该研究通过对果蝇多组织进行单细胞核转录组测序后，得到了果蝇细胞图谱。之后对15个组织进行详细的细胞注释，在果蝇头部，注释到了81种主要的神经细胞类型，在果蝇的躯体中注释了最丰富的33种细胞类型。该图谱还可用于进行相同细胞的跨组织分析，作者通过分析血细胞在整个组织中的表达情况，发现了血细胞中最常见的细胞类型——浆细胞，并未在成虫血细胞中观察到叶状血细胞。通过对肌肉细胞在不同组织类型进行比较，发现它们主要在果蝇躯体、体壁和腿部有特定的富集，并发现内脏肌、骨骼肌、间接飞行肌的分离。

通过转录因子分析，找到了500个转录因子和细胞类型具有高特异性，绘制了每种细胞类型中特异转录因子的表达热图。此外，作者还使用SCENIC预测了基于共表达和motif富集的基因调控网络。通过对广泛细胞类型或组织的基因进行比较分析，发现了在各种细胞类型中的常见表达基因和特定表达基因。

通过对性别依赖的基因表达和性别特异性组织分析，发现体细胞中的主要性别决定基因doublesex（dsx）的表达在很大程度上不具有性别特异性，而许多其他基因的表达具有性别依赖。作者进一步对精母细胞和精细胞进行轨迹推断，发现精母细胞期被转录的基因数量持续增加，许多强烈上调的基因在任何其他细胞类型中都没有基本表达。然而，晚期精母细胞显示了来自许多其他细胞类型的标记基因的表达。

动物细胞图谱分析绘制案例：食蟹猴

中文标题：食蟹猴单细胞转录组和调控组参考图谱

英文标题：A reference single-cell regulomic and transcriptomic map of cynomolgus monkeys

期刊：Nature comuiations [IF: 17.694] 2022.07.13

DOI：10.1038/s41467-022-31770-x

实验设计

实验材料：成年食蟹猴

实验方法：选取16个器官（心、肝、脾、肺、肾、胃、结肠、肌肉、气管、主动脉、脂肪、膀胱、舌头、乳腺、子宫和睾丸）

测序策略：10x Genomics单细胞转录组测序（scRNA-seq）和单细胞染色质开放性测序（scATAC-seq）

研究内容

非人类灵长类动物（Non-human primates）在系统发育上与人类非常接近，在遗传、器官发育、生理功能、病理反应和生化代谢等诸多方面表现出与人类相似的特征，是生物医学研究和药物开发的理想实验动物模型。其中，最为典型的代表当属食蟹猴。系统评估食蟹猴等非人灵长类动物模型与人类的细胞组成差异、器官异质性和基因表达时空特异性等在基础研究中具有十分重要的价值。

该研究对成年食蟹猴的16个代表性器官进行单细胞转录组测序和单细胞染色质开放性测序，构建了食蟹猴多器官的单细胞多组学参考图谱，将25万个细胞进行 t-SNE降维聚类得到40余种不同的细胞亚群。

通过对该细胞图谱进行分析，鉴定到了新的细胞类型。为了解析上皮细胞异质性，作者提取上皮细胞并进行亚群聚类分析。根据marker基因的独特表达模式，分析鉴定出14个上皮细胞簇，包括基底细胞、分泌细胞、纤毛细胞和非纤毛细胞。纤毛上皮细胞在各种组织中都占很大比例，为了探索纤毛上皮细胞亚型的发育和功能动态，作者选用纤毛上皮细胞相对较多的器官，使用Monocle和RNA速度分析对纤毛上皮细胞进行轨迹分析，观察到纤毛细胞从祖细胞状态向成熟状态分化的过程，沿着拟时间高表达的基因在与代谢过程、细胞对刺激的反应和防御反应相关的基因本体(GO)术语中顺序富集。

使用CellPhoneDB细胞通讯分析，发现基质细胞、上皮细胞和髓系细胞之间存在强烈的细胞间相互作用。通常，细胞间相互作用的强度和模式是器官特异性的。为了重新绘制调节细胞-细胞相互作用的分子相互作用，作者在不同器官的特定细胞亚群中绘制了配体-受体对，揭示了猴子各种器官细胞间通信的潜在分子机制。

结合表达谱和染色质开放性数据，作者分析预测了控制不同细胞类型基因表达模式的关键调控子。发现SPIB、POU2F2、SPI1、CEBPD和IRF4是髓系细胞中的关键调控子；而FEV具有调节造血干细胞的潜能，该转录因子广泛参与对免疫细胞和上皮细胞的基因表达调控。大多数顺式调控元件(CREs或ATAC峰)来自启动子、内含子或远端基因间调控区。在scATAC-seq数据中预测了9种细胞类型，在RNA簇中发现了两种罕见的细胞类型，单核细胞和循环B细胞，但在ATAC簇中没有发现。总之，本文中的scATAC-seq数据为无偏见地发现食蟹猴的细胞类型和调控DNA元件提供了丰富的资源。

最后，作者进行了跨物种比较分析，通过整合分析器官匹配的单细胞转录组数据，探讨了人、食蟹猴和小鼠三个物种之间的细胞组成和基因表达特异性。猴子和人类在同源基因表达方面表现出明显高于其他比较的细胞类型相似性。其中，免疫细胞相较于非免疫细胞，人类和猴子之间的基因表达具有更高的相似性。间质细胞在人鼠和猴鼠比较中表现出最高的相似性。这些发现表明，猴子在免疫系统中与人类具有高度相似的转录程序，因此可能为研究对癌症或新冠病毒COVID-19等疾病的免疫反应提供理想的模型。

 

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