植物石蜡包埋试剂盒使用方法

试剂盒组成

保存方法

试剂盒常温运输，常温保存，有效时间截止开封后 60 天。

产品介绍

植物石蜡包埋试剂盒，是一种在保留 RNA 完整性的同时又可进行石蜡包埋获得结构完整性 更好的植物切片的试剂盒。目前常用的植物切片方法主要有徒手切片法、石蜡切片法、冷冻 切片法。徒手切片需要新鲜组织，即取即用无法长时间不存组织；冷冻切片法对于细胞结构 大含水量较多的组织无法保证组织结构的完整性；常规石蜡切片法无法保证组织 RNA 完整 性，无法适用于需要长期保存且对 RNA 有要求的试验。本试剂盒通过低温短时间固定透明， 并采用特定包埋石蜡可在包埋时有效降低了组织 RNA 降解。

适用组织类型

幼茎、主根（木质化程度低）；茎尖分生组织、花芽；生长期籽粒（淀粉含量低）、胚珠、 花苞、叶片

需要而未提供的材料

Tween20、无水乙醇、超纯水、移液器、离心管、吸头、0.22um 针头式过滤器、真空浓缩仪、 恒温箱、包埋盒

操作步骤

1 、开始前将组织固定液（确定已添加无水乙醇）吸取 4ml 于 5ml 离心管，放置 4℃预冷

2 、样品准备：用超纯水彻底清洗组织表面所有杂质，去除目标区域组织周围其余组织并将组织修整为 适合包埋大小。（为了石蜡更好渗透组织一般组织取材长度不超过 8mm，厚度不超过 5mm， 直径不超过 1cm；若样本内部有空腔需尽可能暴露空腔，例：包埋花苞样本时裁去花苞顶端 闭合的花瓣暴露空腔方便石蜡进入)

3 、配置 10ml 0.05%Tween 20 ，并进行预冷

4 、将修整好的组织放入 0.05%Tween20 中，室温孵育 15min。

5 、取出孵育后的组织，将组织表面的试剂用无尘纸沾干。

6 、将组织放入预冷的组织固定液中，颠倒混匀，使组织完全浸没并平放于 4℃过夜固定， 固定时间为 15-18h ，固定液体积需要超出组织体积的两倍。同时将石蜡放置于 38.5℃恒温 箱进行溶解。

7 、吸取 4ml Buffer Ⅰ（确定已添加无水乙醇）置于冰上进行预冷，取出固定后的组织，用无 尘纸吸取组织表面多余液体，放入预冷好的过渡液 1 中，冰上孵育 1h 。同时将 BufferⅡ至于 38.5℃恒温箱中溶解。

8 、吸取 4ml 组织透明液置于冰上进行预冷，取出孵育后的组织，用无尘纸吸取组织表面多 余液体，放入预冷好的组织透明液中，冰上孵育 1.5h。

*注意：组织在孵育试剂转换的过程中需快速进行，以免组织表面试剂挥发造成组织表面出现皱缩或风干

9 、BufferⅡ颠倒混匀后，取 1.2ml 置于 1.5ml 离心管中，取出孵育后的组织，用无尘纸吸取组织表面多余液体后将组织放入 BufferⅡ中，将离心管开盖放入真空浓缩仪中进行抽真空1.5h。

*注意：若组织放入 BufferⅡ后 ，试剂出现凝固可置于恒温箱中溶解后再进行抽真空操作， 真空浓缩仪温度 42℃ , 压力小于 40KPa ，转速 1300-1500rpm。

10 、将溶解好的石蜡颠倒混匀，取出离心后的组织，将组织放置于盛有 1.2ml 石蜡的 1.5ml 离心管中，之后将其放入真空浓缩仪中进行抽真空 2h ，间隔 1h 跟换一次新石蜡。

11 、抽真空结束后取出组织，将石蜡加入包埋盒，并将组织按照切片方向放置，调整好后放 置于冰上凝固冷冻。

*注意：多个组织需将组织放置于同一平面，且组织需处于包埋盒中间位置，组织任何边缘不能靠近包埋盒边缘 ，以免切片组织破碎。

12 、将已凝固的包埋块小心放于-20℃ , 冷冻 2h。

13 、将已凝固的包埋块用锡纸包裹小心保存于-80℃ , 避免剧烈磕碰，剧烈磕碰易导致石蜡 块出现裂缝。

*注意：从-20 转到-80 或者干冰的时候，包埋盒的底部一定不要接触到干冰或者冰箱底面。可将包埋盒架起 ，让其缓慢冷却 ，快速冷冻石蜡可能会产生裂纹

常见问题分析

1 、固定后组织变色或者部分变色

可能原因：组织固定液造成的组织脱色，不影响后续包埋可继续包埋流程。

2 、石蜡溶解后出现白色团块或未能完全溶解

建议措施： ①升高溶解温度，待完全溶解后在 38.5℃恒温。

3 、浸蜡后组织靠中心结构呈现白色，组织边缘结构呈现透明 可能原因：组织浸蜡不完全

建议措施：加长浸蜡时间，但不可加长超过 1h ，浸蜡时间影响组织 RNA 完整性。