分类： 医学研究
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上篇文章介绍了高通量测序后的实验验证手段，主要介绍了表达量验证、RNA结合蛋白、亚细胞定位。本文从功能方面来对转录组测序的结果进行验证，功能方面无非就是使感兴趣的基因的表达升高（功能获得）或降低（功能缺失）看样品表型是否有变化。基因过表达和基因沉默是研究基因功能的两个重要手段。

功能获得研究

功能获得：过表达基因

构建克隆，将目的基因连接在特定的载体（可以是慢病毒载体、腺病毒载体、质粒）上,在载体上一般含有增强基因转录的promoter。将克隆导入表达细胞中，即转化或转染（如果是昆虫表达系统,构建的质粒还需要先转座成为杆状病毒基因组才能用于转染）。转染进入细胞内的外源基因在其上游强启动子的作用下可以直接过量表达。

功能缺失研究

功能缺失：敲除、敲减、沉默基因表达

常用的沉默基因表达方法有，RNA干扰、CCRISPR/Cas9、反义寡核苷酸、位点反转和启动子缺失等方法。可根据感兴趣RNA的亚细胞定位选择合适的敲减方法，如RNA干扰作用只作用在胞浆（胞浆+细胞器=胞质）内，无法对细胞核起作用，此时siRNA或者shRNA方法可能不适用，需要用其他方式进行基因沉默。

反义寡核苷酸

反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide）是指进行了某些化学修饰的短链核酸（约15-25个核苷酸组成），其碱基顺序排列与特定的靶标RNA序列互补，进入细胞后可按照Watson-Crick碱基互补配对的原则与靶标序列形成双链结构。反义寡核苷酸与靶标RNA结合后可抑制靶标RNA的表达。

RNAi

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(double stranded RNA, dsRNA，与内源性mRNA编码区同源的双链RNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默的现象。这种转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被称为RNAi。

RNAi的实现有两种方式，一种是直接购买siRNA寡核苷酸片段，转染到靶细胞中；另一种是利用shRNA慢病毒载体构建稳转的细胞系，shRNA在细胞中被加工为siRNA，进而发挥RNAi的作用。

CRISPR/Cas9

CCRISPR/Cas9是一种由RNA指导的，利用Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术。该技术可方便快捷对任意基因进行编辑改造，比如基因敲除，敲入，定点突变等，不过却有相当的脱靶概率

从哪些方面可以看到基因表达的变化对表型造成变化呢，一般都是由浅入深，由细胞模型到动物模型！有了这种验证，想发低分文章都不能够！

细胞实验

通过改变该基因在细胞内的表达，来探讨细胞表型是否会发生改变。如细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期、迁移侵袭、细胞粘度、耐药，还有难一点的血管形成、能量代谢等。

细胞表型的改变通常进行正反两种实验，如敲除某基因验证细胞凋亡时，做TUNEL实验验证其凋亡后，还需Rescue实验将敲除基因重新导入细胞看是否能挽救表型。

细胞增殖

CCK-8/CFSE流式法、克隆形成实验、MTT检测细胞增殖

细胞凋亡

流式细胞术、Tunel法、Annexin V/PI双染法，以及细胞凋亡形态学检测（光学显微镜和倒置显微镜下观察细胞形态学改变，荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜观察细胞核染色质的形态学改变）

细胞迁移和侵袭

Transwell

如果用matrigel胶包被transwell小室可以检测肿瘤细胞的侵袭能力（invasion）；反之，不包被transwell小室检测肿瘤细胞的迁移能力（migration）。

是不是看不懂，没事，多看看文献，做的时候自然就懂啦……

 

动物实验

通过改变关注基因在动物内的表达，来探讨动物的表型是否会发生改变。因此，构建模拟人类疾病表型的动物模型至关重要。

医学动物模型

  • 诱发性动物疾病模型

    人为地诱发动物产生类似人类疾病模型

  • 自发性动物模型

    不加任何人工诱发，自然条件下自然产生疾病的动物。

  • 抗疾病型动物模型

    即特定的疾病不会在某种动物发生，可研究天然抗性的因素。

  • 生物医学动物模型

    动物正常的生物学特征来提供人类疾病相似表型的疾病模型。

常见肿瘤模型

  • 自发瘤模型

    未经任何有意识的人工处理，自然形成肿瘤

  • 诱发瘤模型

    利用外源性致癌物引起细胞遗传特性改变，从而出现异常生长活性细胞，形成肿瘤。常用实验动物为大鼠，也有用小鼠、豚鼠、兔、犬等。

  • 移植瘤模型

    将动物或人体肿瘤细胞/组织移植到动物体内连续传代而形成肿瘤。肿瘤研究中最常用的是裸鼠模型，即建立皮下移植瘤模型（将肿瘤细胞或肿瘤组织直接种植在小鼠的皮下）。

    注：不易成瘤的肿瘤组织一般选择肿瘤肾被膜下种植移植瘤模型

  • 基因组修饰模型

    通过在动物整体敲除或插入特性的基因而建立的肿瘤模型。

采用所研究的疾病/性状对应的动物模型，对动物模型采用上述技术对特定基因进行过表达或沉默处理，接下来去检测相应的指标。如采用NB技术检测相应基因的表达、肿瘤相应的生长曲线、HE检测组织的形态变化等。

 

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