《cell reports》慢性肉芽肿病的发病机制新发现

近日, 天津医科大学基础医学院在cell reports杂志在线发表了研究论文”Single-cell and spatial transcriptomics reveal the pathogenesis of chronic granulomatous disease in a natural model”。

研究背景

慢性肉芽肿病（Chronic Granulomatous Disease, CGD）是一种由NADPH氧化酶2（NOX2）复合体功能缺失突变引起的原发性免疫缺陷病。这种缺陷会导致产生ROS的多种先天免疫细胞受到损害，机体抵御微生物的能力下降，导致CGD患者易发生反复感染和过度炎症反应。本研究通过构建自然CGD小鼠模型，结合单细胞转录组（scRNA-seq）和空间转录组技术（包括BMKMANU S1000平台），深入解析了CGD肺部肉芽肿形成的细胞与分子机制，从CGD肺肉芽肿组织中鉴定出具有NOS2高表达特征的中性粒细胞和MMP12+巨噬细胞，并提出MIF和Morbidity为CGD治疗的潜在靶点。

研究内容及结果

1、通过接触清洁环境（CL）建立CGD肉芽肿模型

通过不同环境暴露（SPF或CL）实验，系统研究了环境病原体对CGD遗传背景小鼠表型的影响。表现为HE染色全肺叶显微图像可见CL环境下的Ncf2−/−小鼠肺部出现明显的肉芽肿结构，伴随炎症细胞浸润和组织坏死，其他组小鼠肺部正常。免疫荧光显示肉芽肿中的巨噬细胞（CD68+）表达上皮标志物E-cadherin，提示巨噬细胞发生上皮样转化。通过ELISA法检测CL Ncf2−/−小鼠血清中的IL-1β和IFN-γ炎症相关蛋白水平较CL WT组增加。16S rRNA/ITS 测序显示CL Ncf2−/−小鼠肺部细菌（如克雷伯菌和葡萄球菌）和真菌（如Talaromyces）负荷显著增加。

2、单细胞分辨率下小鼠肺部免疫景观的分析

通过单细胞RNA测序和流式细胞术分析发现CGD小鼠肺部炎症微环境以髓系细胞浸润为主，提示其参与肉芽肿形成。其中单细胞测序，最终保留了25296个高质量细胞样本，每个细胞平均包含6466条比对读数和1972个基因，并识别出9种免疫细胞类型及九种基质细胞类型。还发现一个以细胞周期相关基因（Mki67和Top2a）高表达为特征的细胞簇。通过流式细胞术分析发现，CL Ncf2−/−小鼠中CD11b高表达的F4/80+MDMs在比例和绝对数量上均显著增加，这些结果揭示了慢性肉芽肿性葡萄膜炎（CGD）小鼠在肺部感染过程中免疫细胞组成的显著变化，尤其是中性粒细胞和MDMs的明显聚集现象。

3、CGD小鼠中性粒细胞的转录改变

研究显示，中性粒细胞分为6个亚群，其中Neu6亚群在CL Ncf2−/−小鼠中显著扩增且Neu6高表达促炎基因（如Nos2、Mif、Tnf、Il1b）。NO是一种在病原体清除过程中起关键作用由NOS2合成的可扩散小分子，CL Ncf2−/−小鼠肺部的总NO生成量显著升高。流式验证显示CL Ncf2−/−小鼠肺中NOS2high中性粒细胞比例显著增加。这些结果均提示NOS2high中性粒细胞通过产生一氧化氮（NO）和促炎因子，驱动肉芽肿核心区的炎症反应。

4、CGD小鼠单核细胞-巨噬细胞区室的转录改变

通过对巨噬细胞亚群进行聚类分析和功能富集，发现巨噬细胞分为5个亚群，Mac1亚群在CL Ncf2−/−小鼠中显著增加。Mac1同时表达M1（Nos2）和M2（Arg1）标志物，以及促纤维化基因（如Mmp12、Spp1）。免疫荧光显示MMP12+巨噬细胞特异性分布于肉芽肿外围。以上结果提示MMP12+巨噬细胞具有混合表型，可能通过细胞外基质重塑促进肉芽肿的纤维化包裹。

5、空间转录组揭示肉芽肿结构

使用SeekSpace和BMKMANU S1000平台分析肺组织切片的空间转录组。研究表明肉芽肿核心区富集中性粒细胞（Neu6亚群），外围富集巨噬细胞（Mac1亚群）和成纤维细胞。Mac1高表达促炎（Nos2）和促纤维化（Mmp12、Fn1）基因。成纤维细胞高表达胶原基因（Col1a1、Col4a1），提示其参与纤维化。

以上结果提示通过BMKMANU S1000平台进行的空间转录组发现Neu6占据肉芽肿中心区域，而Mac1和成纤维细胞在外围区域参与细胞外基质重塑和纤维化包被过程。明确了肉芽肿中不同细胞的分布和功能分工，揭示了炎症与纤维化的协同作用。

6、干预策略的效果验证

通过对巨噬细胞亚群进行聚类分析和功能富集，发现巨噬细胞分为5个亚群，Mac1亚群在CL Ncf2−/−小鼠中显著增加。Mac1同时表达M1（Nos2）和M2（Arg1）标志物，以及促纤维化基因（如Mmp12、Spp1）。免疫荧光显示MMP12+巨噬细胞特异性分布于肉芽肿外围。以上结果提示MMP12+巨噬细胞具有混合表型，可能通过细胞外基质重塑促进肉芽肿的纤维化包裹。

研究总结

首次通过环境暴露构建自然CGD模型，结合多组学技术解析肉芽肿的细胞和分子机制。本研究揭示了CGD肉芽肿中NOS2high中性粒细胞和MMP12+巨噬细胞的协同作用，并提出MIF和Morrbid作为潜在治疗靶点，为CGD的精准干预提供了理论基础。BMKMANU S1000空间转录组通过高分辨率空间定位明确揭示了中性粒细胞（Neu6亚群）在肉芽肿核心、巨噬细胞（Mac1亚群）和成纤维细胞在外围的分布。在基因表达验证时确认了NOS2、MIF、IL-1β等基因在肉芽肿不同区域的差异表达，这一结果与scRNA-seq结果高度一致，展示了BMKMANU S1000在疾病微环境研究中的高效性。