空间转录组分析揭示大白菜叶球形成的关键过渡叶

 

研究背景

大白菜是一种重要的结叶蔬菜作物。在抽穗期，叶片内外表现出明显的形态分化。然而，这种复杂的叶片形态分化的遗传控制仍不清楚。

研究目的

在此，作者研究了抽穗期连续的头叶从内到外的转录组谱，通过在24个不同的叶片组织中展示了全基因组基因表达的序列-空间剖面，确定了可能在叶片抽穗中发挥重要作用的关键过渡头叶片，为叶状头部的形成提供新见解。

材料方法

在温室盆栽大白菜，使用11周大的植物进行取样。随机选择两个正常生长的大白菜。从外叶到内叶的所有头叶（叶长>2cm）按顺序分离收集，而带有茎尖分生组织(SAM）的幼叶和小内叶（叶长<2cm）不分离，按顺序收集。从每个大白菜头部共得到30片叶子。从内到外，每3片形态相似、大小相近的叶子为一叶轮，共得到10叶轮叶。

从每轮叶片中选取一片叶子，命名为L1-L10，选择SAM、L1、L2、L3、L5、L7和L9进行转录组分析。对于RNA-seq，L2被分为两部分，叶柄(L2R2）和叶片(L2R1），对于L3、L5、L7和L9，则分为五个区域，包括顶部(R1）、外缘(R2）、叶片的中部区域(R3）、叶柄的顶部(R4）和中部(R5）区域进行采样。对来自两个生物学重复（两个叶头）共计48个样品用Illumina平台进行转录组测序。

研究结果

1、转录组测序

对48个样本进行转录组测序，共产生7.43×108高质量cleanreads，皮尔逊相关系数为0.92-0.99，所有生物学重复都高度相关。将cleanread与大白菜参考基因组进行比对，计算基因表达量TPM值，共鉴定出27,876个基因。其中，75.08%的基因在所有样品中都有表达。

主成分分析(PCA）显示沿主成分(PC）1和2有明显的分离。PC1根据与SAM的距离将叶片样本分开，而PC2将叶片和叶柄组织分开。层次聚类分析将样本分为五类，与叶子形态分化一致。SAM和L1的样本形成内叶1(IL1）最接近茎尖的组织。内叶2的叶片（IL2B）和内叶2的叶柄（IL2P）代表L2-L5的叶片和叶柄组织，而外叶（OLB）和外叶柄（OLP）代表L2-L5的叶片和叶柄组织外叶（L7和L9），与叶子形态分化一致。

2、差异表达基因分析

作者在全基因组水平上鉴定了不同叶片中的差异表达基因（DEG），以探索叶片之间的多样性和潜在功能。通过分析，共发现9,133DEG，k-means聚类将差异基因分为14个共表达簇(CEC1-CEC14），这些CEC与图1中的5个聚类簇紧密相关。IL1中DEGs的高表达水平以CEC1和2为代表。CEC1在SAM中高度表达，并以与分生组织发育、组织发育和近轴/远轴极性相关的基因为代表。CEC2在SAM和L1高表达，包含与细胞分裂、细胞增殖、细胞生长和生长素生物合成过程相关的基因。IL2B中DEG的高表达水平以CEC4-6为代表。CEC4、5和6均富集于有机酸代谢过程、淀粉代谢过程、质体组织和硫苷代谢、光合光反应等过程。IL2P中DEGs的高表达以CEC9为代表。CEC9富含植物细胞壁相关过程，包括壁组织或生物发生，以及果胶代谢过程。OLB中DEGs以CEC7和8为代表。CEC7在L7叶片中高表达，并以与蛋白质修饰过程、蛋白质磷酸化和蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性相关的基因为代表。这些结果反映L7具有明显的信号转导和基因调控特征。CEC8在L9叶片中高表达，含有一组与叶绿素分解代谢过程、细胞分解代谢过程、防御反应调节、果糖反应和脱落酸激活信号通路相关的基因。OLP中DEG的高表达水平以CEC11和12为代表。CEC11中的基因在L7-L9的叶柄中高度表达，在任何基因本体(GO）术语中均未富集。CEC12中的基因在L9的叶柄中高度表达。这些基因可能主要参与脱落酸激活的信号通路、茉莉酸（JA）代谢过程、JA反应、防御反应、生物刺激反应、水杨酸反应和外部刺激反应。这些结果表明，L9可能在保护多叶头部免受外部损害方面发挥作用。

3、叶片发育相关基因的表达揭示叶球形成中的关键过渡叶

作者鉴定了细胞增殖相关基因和细胞扩张相关基因。结果表明，大多数细胞增殖基因在IL1HLs中达到峰值，包括SAM和L1，但在IL2HLs和外HLs中迅速下调(图3A），表明细胞增殖基因在不断生长的内叶的起始过程中发挥重要作用。与细胞增殖基因不同，大部分细胞扩张基因在IL2HLs和外HLs的叶片区域高表达，且表达模式更为多样，分为4个簇(图3A）。此外，大部分细胞扩张基因在IL2HLs和外层HLs之间表现出不同的表达模式，导致L7细胞分裂和细胞扩张调控的变化明显高于IL2HLs和外层叶(图3B）。

大白菜HLs的弯曲通常被认为是由叶片正轴和背轴之间的不对称细胞生长引起的。通过分析ad-ab极性基因的表达模式，以探究ad-ab极性基因在头叶曲率中的作用。结果表明，与内部HL相比，大多数ad-ab极性基因在外部HL中显示出显着不同的表达模式。

通过形态学观察、PCA和聚类分析，以及与细胞分裂/扩张和ad-ab极性相关的基因表达，L7位于内叶和外叶之间的边界。作者通过主成分分析和聚类将L7分类为外叶组，最终确定L7是显示三种模式的过渡状态。此外，作者进一步分析了HLs中可溶性糖的积累和相关基因的表达特征，进一步证实L7是叶状头部发育的关键过渡叶。

4、加权基因共表达网络分析

为确定导致过渡叶特殊状态的形成过程，作者进行加权基因共表达网络分析（WGCNA）。WGCNA共确定了17个模块。其中，五个模块（greenyellow、magenta、purple、turquoise和yellow）与过渡叶密切关联。两个模块，greenyellow和magenta，与过渡叶特别相关，并包含许多编码蛋白激酶的基因，包括丝裂原活化蛋白激酶(MAPK）、钙依赖性蛋白激酶(CDPK）和富含半胱氨酸的受体样激酶。关键过渡叶片L7可能受到复杂信号相互作用的调节，不仅是光和其他外部刺激，也有内部激素。

文章亮点

作者报道了大白菜抽穗期的转录组图谱，利用24个空间解剖组织，分别代表大白菜内外叶的不同区域。全基因组转录组分析清楚地将内叶组织与外叶组织分离开来。通过对叶片发育和糖代谢关键基因的空间表达分析，确定了关键过渡叶，关键过渡叶是第一批内弯的叶片。关键过渡叶的形成由一个复杂的信号网络控制，不仅包括内部激素和蛋白激酶，还包括外部光和其他刺激。这个发现为揭示抽穗性状的遗传控制提供了新的见解和丰富的资源。研究过程中作者利用生活中常见材料，结合转录组进行分析，思路简单，设计巧妙，值得借鉴学习。

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