分类: 转录组测序

中文名:多组学揭示了奶牛产奶量和质量的功能基因组和代谢机制

英文名:Multi-omics reveals functional genomic and metabolic mechanisms of milk production and quality in dairy cows

杂志:Bioinformatics,2020

影响因子:5.61

研究背景

提高人类不可食用的农作物副产品的利用率是维持畜牧业可持续性的当务之急,在过去的几十年中,已经做出了许多努力来利用农作物副产品作为饲喂奶牛的饲料来源。但是,与高质量和高成本的牧草苜蓿干草(AH)相比,大多数农作物副产品,例如玉米秸秆(CS,是玉米生产的副产品),营养价值较低,通常会降低牛奶产量和品质。许多研究已经使用化学分析来评估这些饲料的营养成分,消化,利用率,微生物发酵的差异及其对牛乳生产的影响。最近,基于组学的技术也已被用于了解饲喂CS日粮的母牛在分子水平上的生理和生物学变化。但是,牛奶的生产过程可能会受到多个器官/组织的影响和调节。对不同器官中复杂的牛奶生产生物学过程的总体调节机制缺乏全面的了解,无法获得更可实现的结果。

研究目的

提高反刍动物对人类不可食用的农作物副产品的利用,以生产供人类消费的优质牛奶是一项新兴的全球性任务。我们进行了一项基于多组学的研究,以了解奶牛饲喂低品质农作物副产品时牛奶生产的调控生物学过程,旨在提高其利用率。

材料方法

1、实验样本:

(1)养殖条件:16头中国荷斯坦奶牛(产奶量=29.4±2.16kg/d;日产奶量=164±27.5d;均价=3.6±1.8;平均±SD)。根据牛奶产量,在随机分组设计中将其分配给以下2种处理方法之一:苜蓿干草为主的日粮(AH,n=8)和玉米秸秆基础饮食(CS,n=8)。AH和CS日粮含有52.9%和54.3%的干物质(DM),16.7%和16.2%的粗蛋白(以DM为基准),31.1%和36.3%的中性洗涤剂纤维(以DM为基准),18.5%和19.5%的酸性洗涤剂纤维(以DM为基础),非纤维状碳水化合物(NFC,DM为基础)分别占40.6%和36%。每天在06:30、14:00和20:00h随意饲喂3次,每次3至5%的饲料,使用混合饲料。

所有母牛都被喂食65天以收集生物流体样本(瘤胃液,血清,牛奶和尿液)。在这项研究中测量了这16头母牛的血液参数,瘤胃氨氮和挥发性脂肪酸。其中,考虑到动物屠宰和多组学测量的成本,按照公开的方法从每组中随机选择6头母牛进行屠宰后再喂养25天以收集肝脏和MG组织。使用SAS的PROCTTEST(版本9.4)分析瘤胃发酵参数,血液参数,瘤胃微生物多样性和功能数据。

(2)样本收集:收集饲喂65天的16头牛生物流体样本(瘤胃液,血清,牛奶和尿液)和血液;再喂养25天后从每组中随机选择6头母牛进行屠宰以收集肝脏和MG组织。测量16头母牛的血液参数,瘤胃氨氮和挥发性脂肪酸。

2、实验方法:

(1)代谢组学:肝脏和MG组织,GC-TOF/MS。

(2)宏基因组:瘤胃微生物组,IlluminaMiSeq。

(3)转录组:肝脏和MG组织转录组分析。

研究结果

1、饲喂基于AH和CS的日粮的奶牛之间的表型变化

与优质饲草(苜蓿干草)相比,以低品质CS喂养母牛时,观察到的牛奶产量,牛奶蛋白,乳糖和牛奶效率显著降低。对血液中葡萄糖浓度的后续分析显示,CS组的血糖浓度显着低于AH组(P=0.03)(表1)。在饲喂CS的牛的瘤胃中,乙酸与丙酸酯的比例和氨氮的浓度均显著较高(P<0.01)(表1)。在CS喂养的动物中,乙酸盐和丙酸盐的瘤胃摩尔比例分别显著较高和较低(P<0.01)(表1)。

Table 1. The blood and rumen fermentation parameters in the dairy cows fed with alfalfa hay and corn stover based diets.

2、根据宏基因组学,AH组和CS组之间瘤胃微生物组的组成和功能差异

从瘤胃微生物群中鉴定出总共784属,包括古细菌,细菌和真核生物,在所有动物中共检测到其中的111属。进一步的比较表明,变形杆菌,纤维杆菌和门菌(图1a)和拟杆菌,副细菌,纤维杆菌,卟啉单胞菌,Paludibacter和Victivallis属的相对丰度显著较高(P<0.05),而在饲喂CS的奶牛的瘤胃中,密螺旋体属和琥珀酸单胞菌属明显降低(P<0.05,相对丰度>0.02%)(图1b)。在396种优势细菌中(相对丰度>0.01%,补充表2),麦芽螺旋体仅在AH组的瘤胃中发现,而在CS喂养的牛瘤胃中,T.saccharophilumandT.succinifaciens的相对丰度显著降低(P<0.05)。在两组奶牛的属或种水平上,古细菌和真核生物的丰度均未发现差异。宏基因组功能分析揭示了两组在1级基因功能中碳水化合物代谢的相对相对丰度不同(图1c,P=0.032)。碳水化合物代谢中第4级功能的比较表明,编码乳醛还原酶(EC1.1.1.77),I型谷氨酰胺合成酶(EC6.3.1.2),甲基丙二酰辅酶A脱羧酶(EC4.1.1.41),琥珀酸的基因相对丰富CS组的脱氢酶(EC1.3.5.1)和α-木糖苷ABC转运蛋白显著降低(图1d,P<0.05)。

Figure 1. Rumen microbial difference between AH and CS groups

3、基于代谢组学和代谢组学综合分析的AH和CS组瘤胃微生物代谢特征差异

瘤胃液中55种明显不同的代谢产物中,CS喂养的动物中49种的代谢产物含量较低,通过将微生物分类群相对丰度,碳水化合物代谢中的基因丰度和17种高度丰富的微生物代谢物相关联,研究了微生物代谢物与微生物之间的关系。核心宏基因组相关元素包括三个细菌属(纤维杆菌,琥珀酸杆菌和螺旋体)),三种细菌种类(解淀粉琥珀酸杆菌,琥珀酸梅毒螺旋体和嗜糖链球菌)和三种微生物功能(甲基丙二酰辅酶A脱羧酶,琥珀酸脱氢酶和乳醛还原酶)(图2a)。琥珀酸脱氢酶基因和解淀粉链球菌的相对丰度分别与16种代谢物(r介于0.43至0.68,P<0.1)和15种代谢物(r介于0.43至0.76,P<0.1)呈正相关。对上述瘤胃代谢组和代谢组的综合分析显示,当给动物喂食CS时,瘤胃中产生较低的丙酸根和较高的乙酸盐的潜在机理(图2b)。

Figure 2. Rumen microbial metabolic signature difference between AH and CS groups based on the metagenome-metabolome integrated analysis.

4、菌体和属水平的微生物分类学分析

代谢物谱分析分别在肝脏和MG组织中鉴定出270和273种代谢产物(重叠179种)。肝脏中28种代谢产物的丰度差异显著(VIP>1&P<0.05);在CS喂养的动物中,其中15个较低,而13个则较高(VIP>1&P<0.05)。在饲喂CS的动物中,MG组织中3种代谢物含量较低,而6种代谢物含量较高(VIP>1&P<0.05)。图3显示了ROC曲线分析的肝脏和MG组织中AUC最高的前3种代谢产物及其在AH和CS组中的相对浓度。肝脏中的马尿酸(HCA,AUC=1,log2FC=7.54;图3a),亮氨酸(AUC=1,log2FC=11.01;图3b),胱氨酸(AUC=0.972,log2FC=-4.24;图3c)表现出最*的预测性能,可以区分AH和CS。

MG中的马来酸(AUC=0.972,log2FC=-2.88;图3d),邻苯三酚(AUC=0.833,log2FC=6.26;图3e)和琥珀酸(AUC=0.833,log2FC=-3.01;图3f)是分离AH和CS动物的潜在生物标记。通过IPA识别,CS喂养的奶牛的肝脏中关键显著下调的途径是氨基酸(AA)代谢(P=1.66E-07,Z评分=-3.12),糖异生(P=3.86E-08,Z评分=-2.61))以及肝脏中的维生素和矿物质代谢(P=1.47E-15,Z分数=-2.42)(图3g);MG中AAs的摄取(P=1.49E-08,Z分数=-2.77),摄取L-AA(P=4.52E-07,Z分数=-2.41),碳水化合物代谢(P=2.10E-11,Z分数=-2.24)和葡萄糖-6-磷酸的氧化(P=1.01E)-11,Zscore=-2.21)途径显著下调。(图3h)

Figure 3. The biomarker and functional analysis in the liver and mammary gland tissues between AH and CS groups.

5、AH和CS组之间差异表达的基因和功能分析

分别从肝脏和MG转录组中分别获得22.63±1.95和20.03±271万原始序列读数。基因表达的密度在每个组织内的饮食处理之间没有显示出明显的差异,但是在两个组织之间存在显著的差异。在AH和CS组之间,总共在肝脏中发现了67个基因(CS组中9个上调和58个下调)DE基因(|倍数变化|>2&FDR<0.05)(图4a)。在CS奶牛的MG中,两个基因(IGFBP1和ENSBTAG00000047957)以及六个基因(包括PDZK1IP1,LALBA,CSN1S2,LOC505033,CSN3和PDPN)分别显著上调和下调(图4b)。基于DE基因,在AH和CS组之间分别在肝脏和MG组织中鉴定出165个和19个功能性GO术语。

Figue 4. The differential expressed genes between AH and CS groups and coexpressed gene module-biomarker correlation analysis in the liver and mammary gland tissues.

6、代谢机制的确定作为营养物质分配的结果

在两个动物组之间,AA代谢途径是肝脏中最显著不同的途径(图5a)。对AA代谢途径的进一步影响分析表明,亚途径,甘氨酸,丝氨酸和苏氨酸代谢的影响较大(图5b,P=0.029,影响值=0.597)。因此,我们对肝脏中与甘氨酸相关的反应进行了彻底的分析,并研究了它们与体内体液中代谢物的关系。综合比较表明,苯甲酸,糖胺(GAA)和HCA在整个人体的AA代谢中起着关键作用,当母牛饲喂CS时,随后会影响牛奶的合成(图5c)。用CS喂养的奶牛肝脏中甘氨酸和HCA的浓度更高,进一步支持了我们的推测,即瘤胃(微生物)和肝脏(宿主)中的苯甲酸代谢都可能受到影响(图5c)。对肝,血清和尿液进行的HCA生物标志物分析显示出一致的结果(图5d),这进一步表明,从肝脏到尿液的HCA循环是CS下牛奶产量变化的生物标志物。

Figure 5. The roles of systematic metabolites across multiple organs and biofluids when cows fed corn stover 。

文章创新点

这项研究揭示了低质饲草饮食下跨不同生物流体和组织的与牛奶生产相关的生物学机制,这为未来作物副产品的利用和可持续反刍动物的生产提供了新颖的理解和潜在的改善策略。总之,对瘤胃,肝脏和MG组织中不同分子(DNA,RNA,代谢物)的多组学评估表明,当给母牛喂食CS时,乳牛生产中所涉及的代谢和分子生物学机制。对高品质和低品质饲料来源的奶牛进行系统的比较,为提高人类不可食用的饲料用于牛奶生产的生物利用度提供了基本的了解。已发现马尿酸是导致牛奶产量低的代谢生物标志物,暗示了与低质饲草利用代谢机制有关的未来评估参数,在开发用于繁殖和选择或分类动物的工具以优化农场管理方面,这是有希望的。

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