《NC》cd8+t细胞：新LncRNA的表达可鉴定病毒特异的效应及记忆CD8+T细胞

研究背景

病毒感染后，CD8 + T细胞扩增并分化成不同类型的效应细胞，抗原迁移至炎症部位杀死抗原表达细胞。 清除病毒后，大多数抗原特异性CD8+T细胞会死亡，但一小部分长寿命的记忆细胞仍然存在。综合性研究已经确定了与该过程相关的蛋白编码基因转录水平的变化。在效应时期，细胞可表达与增殖、迁移和细胞毒性相关的基因。病毒清除后，多数基因表达恢复初始状态，但许多关键转录因子（Tbx21,Prdm1）、迁移因子（Cd44, Cxcr3）和细胞因子受体（Il12rb, Il18ra）的水平仍处于高水平以确保可快速恢复效应状态。

更重要的是，小鼠和人在效应及记忆T细胞分化中已观察到一些相似的基因程序。这些研究集中于编码转录本的水平，但目前关于非编码转录本在这一过程中的表达变化鲜有报道。作者基于之前工作采用RNA-seq展开研究，以鉴定响应病毒感染的人和小鼠CD8 + T细胞中长非编码RNA（lncRNA）表达的变化。通过lncRNA测序研究，鉴定出上百条未注释的lncRNA，基于表达分析可以将lncRNA对初始、效应和记忆CD8+T细胞亚群分类，意味着在抗原启动分化过程中它们可能参与决定不同分化命运。通过小鼠与人类lncRNA表达数据的比较，发现具有保守性的lncRNA。

材料和方法

● LCMV感染及细胞分选： LCMV病毒感染小鼠，分选不同类型的细胞进行后续RNA测序。

● LncRNA测序研究：基于RNA-seq进行lncRNA表达分析。5组类型细胞，包括native、终末分化效应T细胞（short-livedterminal effector ,TE）、记忆前体T细胞（memory precursor ，MP)、中心记忆T细胞（central memory ，CM) 、效应记忆T细胞（effector memory ，EM)，每组3个重复。

● 生信分析：转录本组装、表达分析、同源性分析。

● RACE验证。

研究结果

1、通过小鼠CD8+T细胞测序数据，基于转录组组装发现未注释基因，以及T细胞分化过程中lncRNA的动态变化。

从LCMV感染小鼠中分离病毒特异性的CD8+T细胞亚群，对不同类型的细胞进行RNA-seq。包括初始T细胞、终末分化效应T细胞（short-livedterminal effector ,TE）、记忆前体T细胞（memory precursor ，MP)、中心记忆T细胞（central memory ，CM) 、效应记忆T细胞（effector memory ，EM)。基于数据组装分析，共鉴定到13909个unique genes，75%是蛋白编码基因，25%是非编码。在非编码基因中，三分之一在数据库中未收录，因为认为是新基因。这些新基因比已注释非编码基因有较高的表达水平，但这两类基因均比编码基因低表达。采用CPAT进行编码潜能分析，大部分新转录本包括单个外显子，不到25%的新转录本包括2个及以上外显子。虽然不具有蛋白编码潜能，但大部分新基因在CD8+T细胞分化过程中表现出特异性，包括记忆细胞中的特异性表达。

在13909基因中，与初始细胞相比，有5266个至少在一个细胞亚型中差异表达。感染过程中，884个lncRNA差异表达，其中有525个未注释。在感染8天后的TE和MP细胞之间有181个差异非编码基因，其中123个未注释。48天后，378个非编码（230新基因）与初始相比显著差异表达，但在CM和EM细胞相比，167个差异基因表达，29个为非编码（20个新的）。

2、lncRNA表达分析分类CD8+T细胞亚群。

由于在CD8+T细胞分化过程中表现出来的差异表达，进一步通过PCA分析是否可以对不同亚群细胞分类。结果表明编码基因、非编码和新基因均可以分类。其中组装得到的新基因分类结果与编码基因分类结果一致，说明这些新基因对T细胞的分化及功能的重要性。为进一步鉴定特异性lncRNA，筛选具有类似表达模式的差异基因。鉴定出14个差异表达的cluster，其中非编码与编码并未表现出cluster分离，表明二者有相似的表达过程。比如一些非编码基因在CD8+T细胞激活后表达上调或下调，在记忆期维持效应水平，与编码基因Cd44和Cd200类似。第8天的MP和TE细胞相比，差异lncRNA存在于一些cluster中（clusters 4, 8, and 13 ），表明lncRNA可能涉及T细胞早期分化命运。

3、人抗原特异性CD8+T细胞中lncRNA的表达分析。

基于之前健康志愿者的测序数据（采用YFV-17D黄热疫苗，分选CD8+T细胞，收集初始T细胞，14天CD8+T细胞、28天CD8+T细胞、记忆细胞），进行转录组分析。鉴定出已注释的3165个非编码转录本，1098个未注释的。与小鼠数据相比，人数据中也表现出编码基因表达高于非编码基因。同样许多鉴定的新转录本是单外显子，编码潜能低于鼠鉴定的转录本。与小鼠数据类似，许多新转录本在T细胞分化中表现出特异性。

基于差异分析，4099个基因至少在一个分化时期显著变化，838个是非编码基因。28.3%的编码基因在感染过程中显著变化。非编码基因中，相比已知lncRNA，28.3%新lncRNA在感染后显著差异表达，已知lncRNA占比16.7%。接下来同样进行PCA分析lncRNA在分化过程中的作用。与小鼠数据相似，基于编码基因、非编码基因及新基因将T细胞分为3类：初始、效应及记忆细胞。非编码基因的分类结果与编码基因结果类似。基于聚类分析，有11个表达的cluster。与小鼠数据类似，编码基因与非编码基因并未表现出cluster分离。并且有一些时期特应性的cluster，比如cluster3在激活后上调且在病毒清除后保持该水平，cluster2则恢复到初始状态，cluster1则接近于初始水平。许多下调基因在记忆形成后恢复到初始水平（cluster11），但有些基因比初始状态更低（cluster10）。结合小鼠测序数据，结果表明非编码基因在多种哺乳动物CD8+T细胞分化中发挥重要作用。

4、CD8+T细胞中lncRNA表达的保守性。

由于lncRNA在小鼠与人数据表现出的生物学过程相似性，将两者转录本序列进行比对。仅有一部分小鼠lncRNA包含人转录本同源序列，当然也会存在比对到人编码基因及假基因上的序列。许多同源lncRNA在对比物种上有多个同源基因座。除了序列保守，共线性（位置保守）也是考虑因素。因此接下来分析T细胞分化过程中保守性的lncRNA。通过比较二者效应和记忆期基因的差异倍数，但在任一个阶段未发现保守且表达显著相关的基因。但这些保守性基因在这2个时期表现出中度相关(r = 0.36 and 0.46, p = 0.0007 and 0.0008, respectively)。

小结

文章基于RNA测序对小鼠T细胞不同阶段的基因表达进行综合比较，鉴定出不同阶段特异表达的基因，包括已知和新的lncRNA，其可能参与作用于细胞分化过程。此外，通过与人的测序数据相比较，具有序列保守的lncRNA在二者间的表达类似，表明在CD8+T细胞分化过程中的进化保守性。

参考文献

Hudson WH, Prokhnevska N, et al. Expression of novel long noncoding RNAs defines virus-specific effector and memory CD8+ T cells. Nature Communications, 2019.

 

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