英文名：High-Throughput Data of Circular RNA Profiles in Human Temporal Cortex Tissue Reveals Novel Insights into Temporal Lobe Epilepsy
中文名：人类颞叶皮层组织的circRNA高通量测序揭示颞叶癫痫的新认知
杂志：Cell Physiol Biochem 2018
影响因子：5.104
合作单位：首都医科大学附属北京天坛医院北京神经外科研究所
01.研究背景
癫痫是一种常见的慢性神经系统疾病，影响近5000万人，约占世界人口的0.4-1%。颞叶癫痫(TLE)是一种常见的癫痫，伴有药物抵抗，需要对癫痫灶进行手术切除。人类的TLE病变包括了在钩回、杏仁核和侧颞叶皮层的异常，其中许多异常与兴奋性离子通道和改变的离子型受体有关。全基因组表达谱揭示了在人的TLE组织中，离子通道和相关受体基因的模式发生了显著的改变，但是这些基因表达如何被调控仍然未知。
最近的基因组学研究揭示了许多与各种疾病的基因调控相关的非编码RNA (ncRNAs)。人类癫痫中非编码RNA的表达也发生了改变，可以作为一种新的、非侵入性的生物标志物来改善目前的癫痫诊断。环状RNA (circRNAs)是一种独特的非编码环状RNA，circRNA与microRNAs (miRNAs)相互作用，并作为miRNA海绵，通过circRNA-miRNA-mRNA网络在神经系统疾病中调节基因表达。研究表明环状RNA在神经元功能中发挥重要作用，尤其是在突触中。组织学研究结果证实，边缘系统的突触重组似乎能逐渐增强皮质兴奋性，并可能导致癫痫发作。然而，circRNAs在癫痫中的作用仍是未知的。
在本研究中，为了评估circRNA在人体内的作用，作者采用了高通量测序方法，测定TLE患者和非TLE患者颞叶新皮质中circRNA表达水平，并对环状RNA的功能进行了注释。作者描述了一个包含潜在基因与circRNA-miRNA的网络。
02.材料方法
试验材料：非TLE对照组和TLE组患者的颞叶新皮质组织
测序方法：circRNA seq，Illumina HiSeq4000（北京百迈客）
03.研究结果
1.临床和病理数据
术中脑电图（I-EEG）和免疫染色（NeuN和GFAP）结果表明，相比于非TLE对照组，TLE组患者具有典型的异常情况。
图1. I-EEG和免疫染色结果
2.颞叶皮层circRNA表达谱
在两组样本中检测出了78983个circRNA，15.29%为已知circRNA，84.71%是新发现的circRNA。其中，58558个circRNA位于外显子区，10520个位于内含子区，其它位于基因间区（图2a），不同类型circRNA的表达水平如图2b所示。已知的circRNA整体表达水平比新circRNA高，外显子circRNA表达水平高于内含子和基因间区的circRNA表达水平。表明样本中大多数circRNA位于外显子区，并且可能在癫痫中发挥调节作用。
所有circRNA和外显子circRNA的GC含量高于circRNA数据库，但内含子和基因间区circRNA的GC含量与circRNA数据库中相似（图2c）。此外，circRNA长度的峰值主要集中在558 bp区域，而在数据库中circRNA的峰值则集中在4105 bp区域。新circRNA与已知的circRNA长度具有相似的特征，表明新circRNA数据是可靠的（图2d）。图2e显示了circRNA在人类染色体上的基因分布，circRNA也广泛分布于所有的染色体中，但在Y染色体和着丝粒上的分布较少，在每条染色体的染色体臂两端有较高的分布。
图2. CircRNA表达谱
3.CircRNA差异表达分析及qPCR验证
TLE与对照样本之间有442个显著差异表达的circRNA (FC≥2，FDR≤0.05)，其中254个下调，188个上调（图3a）。circRNA的来源基因功能注释结果表明，这些差异表达circRNA可能与GTPase活性、蛋白转运和蛋白磷酸化等途径有关，这些途径在癫痫的发病机制中起着关键作用。为了找出功能性的差异表达circRNA，比较了100个差异表达最显著的circRNA和GO数据库中的5058个功能基因，从中找到了10个与神经功能相关的circRNAs 。
作者选择了10个显著差异表达的circRNA进行qPCR验证，其中有8个circRNA差异显著。结果表明，qPCR试验结果与高通量测序结果基本一致。此外，还选择了表达量差异最显著的两个circRNA（circ-EFCAB2、circa-DROSHA），在28个临床样本中进行qPCR试验（图3c），结果表明这两个circRNA在对照组和TLE组之间显著差异表达。综上所示，发现了circ-EFCAB2和circ-DROSHA在TLE患者颞叶皮层组织中存在着异常调节。circ-EFCAB2和circ-DROSHA的来源基因分别为EFCAB2和DROSHA。EFCAB基因家族主要选择性地与钙离子非共价作用。EFCAB2上调会影响钙离子的结合，从而导致癫痫的发生。DROSHA是一种双链RNA特异内切核糖核酸酶，它影响miRNA生物合成的初始阶段，其丢失会导致神经元和神经胶质异常、癫痫和神经退行性疾病。因此，circ-EFCAB2和circ-DROSHA可能是通过调节EFCAB2和DROSHA参与TLE。
图3. 差异表达circRNA及其来源基因注释、qPCR验证
4.circRNA作为miRNA海绵参与癫痫发病的分子机制
为了确定circ-EFCAB2和circ-DROSHA的功能，利用TargetScan和Miranda来预测靶向miRNA。预测结果表明，circ-EFCAB2的前5个靶向miRNA分别为miR-5787、mir – 684 -5p、miR-3929、miR-6780a-5p和miR-4739，而circ-DROSHA的靶向miRNA分别为miR-1252-5p、miR-651-3p、miR-4446-5p、miR-548ab和miR-4762-3p。通过靶基因预测，找到了上述的10个miRNAs对应的靶基因，构建了circRNA-miRNA-mRNA网络（图4）。其中，circ-DROSHA的间接靶基因CLCN6是一种氯离子通道家族（CLCs）成员，它与电兴奋性、跨上皮转运、电中性和离子稳态等多种生理过程有关；而其打分最高的靶向miR-1252-5p所对应的靶基因ATP1A2与癫痫具有很强的相关性，也是人类癫痫的候选基因。
由于circ-EFCAB2和circ-DROSHA被预测为这些miRNA的海绵，它们可能会吸附这些miRNA而影响靶基因的表达，从而影响TLE的发病机制。
图4. circ-EFCAB2、circ-DROSHA调控网络
由于circ-EFCAB2和circ-DROSHA被预测为这些miRNA的海绵，它们可能会吸收这些miRNA而影响靶基因的表达，从而影响TLE的发病机制。
总结
综上所述，作者对TLE患者颞叶新皮质组织的circRNA表达谱进行了全面的分析，确定了癫痫患者的8个circRNA。其中显著差异表达的circ-EFCAB2和circ-DROSHA可能是通过调节来源基于EFCAB2和DROSHA参与TLE，也可能作为miRNA的海绵影响靶基因的表达，参与TLE的发病机制（图5）。
图5. circ-EFCAB2、circ-DROSHA参与癫痫发生的分子机制示意图
参考文献：Li J, Lin H, Sun Z, et al. High-Throughput Data of Circular RNA Profiles in Human Temporal Cortex Tissue Reveals Novel Insights into Temporal Lobe Epilepsy[J]. Cellular Physiology and Biochemistry, 2018, 45(2): 677-691.
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