分类: 群体遗传

12篇QTL定位相关的SCI文章“横空出世”了~~~

在这里,小编必须要恭贺各位老师们在新年伊始取得了“开门红!

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(文末继续有中标的国自然标书分享~)

本期,为大家解读通过SLAF-BSA对小麦抗病性进行基因定位的文章,一起来看一下长江大学马东方副教授和朱永兴讲师在《Scientific Reports》上发表的“利用SLAF-BSA快速鉴定小麦空间辐射突变体中抗条纹病基因”。

1.研究背景

普通小麦是主要的粮食作物之一,但由于小麦条锈病菌的侵害,使得小麦产量逐年降低,尤其是在西南和西北地区。条锈病抗性分为全生育期抗性(ASR,包括幼苗和成株)和成株抗性(APR),前者通常是单个主效基因控制的,是倾向于针对某一特定菌种而产生的抗性,而后者的抗性则不针对某一特定菌种且为数量遗传,其保护水平通常是不完全的,并受生长阶段,温度,湿度和接种量的影响。因此,定位这两种小麦抗条锈病抗性基因是当务之急。

2.材料与方法

01.材料
亲本:铭贤169(Mingxian 169)×R39,铭贤169为感病栽培种;R39为抗性品种,是郑麦9023(zhengmai 9023)突变体材料自交8代所形成
群体类型:F2群体
混池规模:45+45
其他材料:F1、BC1和郑麦9023

02.实验处理
在可温控的温室内,利用7个条锈病菌 (CYR29, CYR30, CYR31, CYR32, CYR33, Su11-4 和 Su11-11)的新鲜夏孢子对双亲、F1、BC1,F2和郑麦9023的完全展开的第一片子叶进行侵染。
幼苗试验处理:先在10°C的培养室内培养24h,然后移置温室,在环境变化的条件下培养(循环方式:18°C下,光照16h;10°C下,黑暗8h);
成株试验处理;将发芽幼苗在4℃冰箱中春化5周,然后移栽到盆中温室生长。
1个月后,孕穗期的亲本和后代接种混合有滑石的夏孢子(urediniospore)并如上所述温育,接种18-20d记录侵染类型(IT),并按前人划分标准分为0-4。IT 0至2+的认为具有抗性,而IT3至4的则认为是易感的。
收集种子测量千粒重(TSW)。每个栽培品种三个生物学重复。

03.技术手段
1)SLAF-seq+BSA:铭贤169、R39、感病混池和抗病混池(混池材料各45个),计算方法:SNP-index和ED;
2)SSR-遗传图谱:铭贤169、R39、高感病混池和高抗病混池(混池材料各10个,来自上述测过序的材料)(互为验证);
3)qRT-PCR:每次实验做了三个生物学重复,每个重复两次技术性重复。

3.实验结果

01.小麦突变体R39具有成株抗性
在抗性鉴定中发现,其在幼苗期对7种病菌均呈现感病,而成株期均呈现抗病(图1a);而郑麦9023和铭贤169全生育期均为感病。此外,R39的千粒重显著高于郑麦9023和铭贤169,这表明在条锈病发病条件下,R39的籽粒产量更高,种子质量更好(图1b-d)。

图1 抗性和产量评价

02.针对CYR33菌种,R39 的APR由一个隐性基因控制
如表1,F2群体分离比是3:1,所以CYR33的R39 的APR由一个隐性基因控制。这个抗病基因命名为YrR39。在R39、抗性F2和抗性BC1材料中一个显著特征是叶斑点。而且上述两个特征在未接种的群体内也是一样的。

表1 亲本及分离群体抗病和感病频率统计

03.SLAF-seq+BSA的分析结果
利用SNP-index和ED两种算法,将抗病基因YrR39定位在4B染色体上17.39 Mb的区域内。(这里就不细说了,直接上图)

图2 BSA分析的两种方法的结果

04.利用SSR标记验证目标区域
4B染色体上有83对SSR是有多态性的,但是其中只有8对能清楚的区分双亲及两个混池。利用其对462个F2个体进行基因分型并构建遗传图谱,将YrR39定位于染色体4BL 的2.6cM的区间内,其侧翼标记为Xwmc495和Xwmc48(如图3)。这与BSA分析结果一致,也验证了SLAF-seq检测结果的准确性。

图3  染色体4BL的连锁图谱

05.条锈菌感染对候选基因表达的影响
目标区域包含126个基因(表3),通过功能注释,找到21个与条锈病抗性相关的基因,拟定为候选基因,并进行qRT-PCR验证。结果表明,在病菌接种后12、24、48和96h,只有候选基因Traes_4BS_C868349E1(注释为F-box / LRR-重复蛋白)在R39中显示出比在铭贤169中更高的表达水平(图4)。 这表明其可能参与了R39对条锈病的抗性。

表3 关联区域内结果

图4  21个候选基因的qRT-PCR结果

借鉴之处

1. 表型鉴定的方法是基于前人的方法,且将突变的原始材料郑麦9023作为对照,增加结果的可靠性;
2. 利用SSR图谱和测序结果互相验证,确保结果可靠;
3. 找到区间,然后看功能注释找候选基因,对候选基因进行qRT-PCR验证(也可用RNA-seq来验证)
4. 研究斑点性状这个病症与抗性的关系,这一点来源于细心的观察和不断的思考(思考什么呢?你懂得~~);
5. 作者仍在继续验证这个基因(科研的态度)。正所谓真金不怕火炼,前面所提几种方法均可对其验证,以增加可靠度。

遗传群体事业部 小猴子丨文案
许语辉 | 审核
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