微生物多样性在水环境中的应用：微生物多样性测序结合qPCR揭示人粪便污染对水体影响

2022年9月30日，南开大学与山西医科大学、常州大学合作在JCR Q1区《Journal of Hazardous Materials》（IF：14.224）发表题为“Unraveling the influence of human fecal pollution on antibiotic resistance gene levels in different receiving water bodies using crAssphage indicator gene ”的研究论文，该研究检测了人类粪便和一系列受人类粪便影响的相关水体中抗生素耐药基因(ARGs)、人类粪便污染指示基因crAssphage和抗生素的共存情况，结果表明，68.2%的研究水体中检测到了crAssphage，证实了普遍存在的人类粪便环境污染。ARGs和crAssphage丰度都表现出从排放源（污水处理厂）到受纳水体的距离衰减效应。供试受纳水体中ARG的丰度与人类粪便污染指示基因crAssphage丰度显著相关，与抗生素残留浓度不相关，证明了大量排放的人类粪便污染对受纳水体ARGs的环境污染起到关键影响。该研究对明晰受人类粪便污染影响的水体中ARGs的污染特征和来源提供了重要见解。

发表期刊：Journal of Hazardous Materials IF：14.224

发表时间：2022.09.16

研究背景

环境中细菌的抗生素耐药性由于与临床病原体的抗生素耐药性密切相关而受到越来越多的关注。自从人类在临床上使用抗生素以来，环境中的抗生素耐药基因(ARGs)亦有所增加。然而，这种增加是否直接来源于环境残留抗生素的选择性压力还是来源于人类大量排放的粪便污染却不得而知。在该项研究中，调查了人类粪便以及受人类粪便污染影响的不同污水处理厂受纳水环境中的 ARGs、crAssphage 和抗生素残留特征，以期了解抗生素的选择压力和人类粪便污染对受纳水体ARGs污染的影响。

技术路线

主要结果

1.人类粪便和水环境中 ARGs 的污染特征

运用高通量qPCR方法从采集的样本中检测到89个ARGs和5个MGEs。在所有检的基因中，只有超广谱β-内酰胺酶编码基因blaTEM在所有样本中都被检测到。在>80%的样品中检测到strB、ermF、aadA1等ARGs(图1A)。在所有采集的人粪便中检测到28种ARGs，包括tetW、 cfxA、 tetO-01、tet(32)、blaTEM-1等，而在所有水样中仅检测到strB和blaTEM-1(图2)。此外，比较了不同的环境，发现在人类粪便和水中检测到38个ARGs(图3S1B)。总体而言，人粪便的ARG相对丰度显著高于所有水样。

ARG多样性也随着水从污水处理厂向自来水的输送而减少(1C)。所有样本的ARG谱的PCoA表明，不同类型的样本包含显著不同的ARG成分。从环境样品中分离出人类粪便中的ARGs(图1D)，表明肠道具有独特的ARG图谱。这可能是因为与环境相比，肠道的条件不同。来自污水处理厂和受纳河水的样品聚在一起较近，证实了污水处理厂出水的排放对受纳河中的ARGs有很大影响。同样，湖泊和自来水更倾向于聚集在一起，与所研究的湖泊都是自来水水源一致。上述结果表明，在所研究的样品中普遍存在ARGs，污水处理厂携带的ARGs可能污染不同的受纳水体。

2.人类粪便污染对水环境中 ARGs 的贡献

借助人类粪便指示剂 crAssphage (CPQ_056)，分析了人类粪便排放对当地水环境中ARGs的影响。结果表明，crAssphage在所有环境样品中的检测频率为 68.2%，相对丰度范围为2.68×10-6至1.96×10-2每个16S rRNA基因拷贝（图2），表明超过一半的水样（湖水、自来水、污水处理厂和受纳河水）被人类粪便污染。与 ARGs 一致，平均crAssphage 丰度也沿着水流从污水处理厂不同处理单元的污水到受纳河水再到湖泊水体的顺序逐渐减少（图2）。这再次证明了人类粪便污染从污水处理厂的排放源到接收环境有着随距离不断衰减的效应。

进一步的统计分析探讨粪便污染对不同水体中 ARGs 的影响。Spearman相关性分析表明，总ARG相对丰度与crAssphage的丰度呈正相关（图3A）。进一步分析表明，crAssphage 丰度同样与某些 ARG 的丰度显着相关，例如氨基糖苷类、FCA、MLSB、其他/外排、四环素和磺胺抗性基因（图3B-F，表S5）。14 种ARG亚型和ermF与 crAssphage 显着相关。更重要的是，这些 ARGs 亚型也同时在人类和水环境中检出，表明它们可能源自人类粪便并被输送到受纳水体。

此外，人类粪便样本中ARGs丰度与 crAssphage丰度之间没有相关性，证实了肠道里 ARGs 丰度与crAssphage 丰度无关。这对 crAssphage作为人类粪便污染的指示基因至关重要。因此，上述环境样本中ARGs 与 crAssphage 丰度之间的显着正相关表明供试受纳水体中 ARGs 的富集在很大程度上可归因于人类粪便污染。

除了crAssphage 之外，研究者通过构建系统发育树分析了来自所有样品的氨苄青霉素抗性菌株中的 blaTEM-1基因序列（图4）。结果表明，来自四种环境样品（湖水、自来水、污水处理厂和受纳河水）的blaTEM-1与肠道样品的进化关系密切（图4）。该结果表明blaTEM-1可能通过污水排放在人类粪便和受纳水体之间进行传播。然而，需要进一步的研究来验证这些发现。

3.水环境中的 ARGs 丰度与抗生素残留无关

研究者进一步测量了抗生素残留，结果表明，在所有五组中均检测到四环素类、喹诺酮类和硝基呋喃类抗生素。污水处理厂样品中17种抗生素的检出频率高于其他组，占 41.2%~64.7%。同时，在水环境中，污水处理厂的抗生素总浓度也高（289.5±236.7 ng/L），其次是受纳河水（169.8±104.9 ng/L）。自来水在所有样品中的抗生素残留浓度低 (54.7 ± 51.0 ng/L)（表1）。人类粪便中的总抗生素浓度为 17.7±9.2 ng/g。由于粪便提供者在过去六个月内都没有用药史，因此在人类粪便中检测到的抗生素可能来自饮用水或食物。此外，在所研究的人类粪便中检测到某些合成兽用抗生素，如磺胺氯哒嗪和恩诺沙星，也支持了这一结论。对水生环境中残留的抗生素和 ARGs 进行了相关性分析。与 crAssphage 不同，抗生素浓度与 ARG 丰度之间没有相关性。这一结果表明抗生素的选择并不能主要解释供试水环境中 ARGs 的丰度。综上所述，ARGs 和抗生素之间没有相关性，但却显著相关于crAssphage丰度，表明供试受纳水体中 ARGs 的丰度在很大程度上可以用人类粪便污染的程度来解释，本研究并没有观察到明显的抗生素选择ARGs现象。

4.细菌群落特征及其与ARGs的相关性

在人类粪便中，厚壁菌门、拟杆菌门、变形杆菌门和放线菌门是优势门(图5A)。厚壁菌和拟杆菌占肠道菌群总数的(83.5±9.8)%，环境样品中以变形杆菌和拟杆菌为主，变形杆菌所占比例高。在属的水平上，人类的肠道Bacteroides，Faecalibacterium，Bifidobacterium， 和Subdoligranulum.Pseudomonas，而水环境中的优势属为Flavobacterium，Arcobacter和Massilia(图5B)。

细菌群落多样性分析表明，除自来水外，其他水环境样品的平均Shannon指数均高于人类粪便样品(图5C)。PCoA分析表明，人类粪便和环境样本之间的细菌群落组成有显着差异(图5D)。然而，在人类粪便和水环境中存在着167个OTUS属121个常见细菌属，此外，还发现ARGs与所有样品中的细菌群落显著相关(图3A)，这表明细菌群落组成决定了ARG组成，这一现象在各种环境中都被广泛观察到。

在该研究中，84个ARGs、5个MGES和20个细菌门被用来进行网络分析(图6B)。Chlamydiae和Dependentiae 与11种不同的ARG显著相关，表明它们的基因组中可能含有多种ARG类型。四环素耐药基因、大环内酯类耐药基因ermB和氨基糖苷类耐药基因aacA/aphD是四环素耐药基因的潜在宿主。Elusimmicrobia可能是aadE、blaCTX-M-02、Olec和vanRA-01的宿主。Synergistetes 可能是tetW、IS613和catA1的潜在宿主。由于该网络是建立在相关性的基础上，观察到的ARGs潜在细菌宿主仍需进一步的试验验证。

总结

这项研究主要表明，人类排泄物对受污水处理厂影响的受纳水体中的ARGs有显著的影响。ARG和crAssphage丰度都表现出从排放源到受纳水体的距离衰减效应。人类粪便中的blaTEM-1基因与水环境中的blaTEM-1基因具有密切的进化关系。在被人类粪便污染的环境中，粪便污染可能是ARG污染的主要来源。抗生素残留浓度与ARGs丰度之间无显著的相关性，表明环境残留抗生素选择产生ARGs的现象并不明显。该研究促进了公众对人类影响环境中人类粪便污染对抗生素耐药性的影响的理解。

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