微生物多样性测序是对环境样品中细菌（16S rDNA）、真菌（18S/ITS）、功能基因等基因的DNA进行特定长度的PCR扩增并对扩增产物进行测序的分析，可实现对环境样品中的优势物种、稀有物种和一些未知物种进行检测，精准解析微生物在种属水平上的组成和丰度情况，是当前研究环境微生物多样性及群落组成差异的重要技术手段。
近日，百迈客客户文章不断，喜报频频，在恭喜老师论文发表的同时，我们对文章进行了解读，分享给各位读者，本期分享的为研究水体微生物的成功案例，希望能够为各位老师提供研究思路。
中文题目：海洋厌氧氨氧化菌在不同磷酸盐剂量下处理含氮盐水废水的脱氮机理：微生物群落转变和磷酸盐结晶
期刊：Bioresource Technology
影响因子：9.642
发表时间：2021.04
合作单位：青岛大学
研究方法：16S rDNA测序（百迈客提供）+动力学分析
摘要
2021年4月，青岛大学在《Bioresource Technology》发表题为“Deciphering nitrogen removal mechanism through marine anammox bacteria treating nitrogen-laden saline wastewater under various phosphate doses: Microbial community shift and phosphate crystal”的研究论文，该论文主要研究了（1）不同磷酸盐剂量下MAB（marine anammox bacteria，海洋厌氧菌）的脱氮机制；（2）微生物群落变化；（3）磷酸盐沉淀的组成和特征。
文章首先从磷酸盐对含氮盐水废水中MAB主导的厌氧氨氧化过程的影响出发，发现MAB的活性通过加入低浓度磷酸盐增强（5-30 mg/L PO43–P），并且完全去除铵的时间缩短了0.5小时。当PO43–P超过160mg/L时，反应器内形成磷酸钙镁沉淀，底物与生物量的接触受到沉积物的阻碍，MAB的脱氮性能也变差。当PO43−-P到达400 mg/L，氨氮去除率和亚硝酸盐去除率分别降低至0.45和0.43 kg/(m3·d)。实验的158天里，MAB始终是优势菌株，但其相对丰度在400 mg/L PO43–P 时下降了15.4%。此外，沉积物的存在刺激了胞外聚合物的产生，当PO43–P 的浓度为200 mg/L时，胞外聚合物的最大产量达到 11.25 mg/g·湿重。
研究背景
厌氧氨氧化（anammox）作为一种新型脱氮工艺，具有节能、无二次污染等优点，在污水处理领域具有广阔的应用前景。厌氧氨氧化细菌可分为淡水氨氧化细菌（FAB）和海洋氨氧化细菌（MAB），MAB对盐分有很大的耐受性，在处理含氮含盐废水方面具有巨大的潜力。来自一些沿海工厂（例如水产养殖）的污水含有高浓度的盐和磷酸盐，尤其是养殖废水中还含有大量的氨和亚硝酸盐氮，排放到环境水体中会引发富营养化，城市污水处理厂一般在厌氧氨氧化工艺后进行磷回收，因此，残留的磷会通过污泥回流流入厌氧氨氧化池，影响厌氧氨氧化性能。但关于无机磷酸盐多厌氧氨氧化微生物的影响还不明确，以及磷酸盐对含氮含盐废水中MAB（即Candidatus Scalindua）脱氮的影响尚未清晰。
研究方法
反应器：双层序批式反应器（SBR，double-layer sequencing batch reactor），材料为聚甲基丙烯酸甲酯，工作容量为7L，流入体积与反应器体积的交换体积比为5/7。
污水制备：青岛胶州湾海水（35‰盐度和19‰氯度）
检测内容：
①反应器内部温度，②进出水口NH4+-N、NO2–N、NO3–N和PO43–P，③胞外聚合物（EPS），④反应器内的沉淀物质，⑤反应器0（S0）、84（S1）、158天（S2）时生物膜上的样品进行16S rRNA测序（百迈客提供）
实验流程：
图1.实验流程图
主要研究结果
1 在不同磷酸盐剂量下MAB脱氮效果
在整个实验过程中，通过固定进水底物浓度和水力停留时间，保持进水负载率恒定，研究了磷酸盐在158天内对MAB脱氮性能的影响。结果如图2所示，出水NH4+-N和NO2–N在30天时几乎完全被去除（图2a），随着磷酸盐浓度增加，出水NO2–N浓度略有增加。当PO43–P达到120 mg/L时，出水NH4+-N增加，NO2–N超过20 mg/L。当PO43–P浓度增加到160-400mg/L时，出水NH4+-N随着进水磷酸盐的增加而显著增加，最终稳定在76.56mg/L，同时出水NO2–N的浓度增加到了131.29mg/L，NO3–N减少到24.82mg/L。
在PO43–P≤80 mg/L时，氨氮去除率（ARE）和亚硝酸盐去除率（NRE）均保持在90%以上，氨氮去除速率（ARR）和亚硝酸盐去除速率（NRR）分别为0.91和1.18 kg /(m3·d)（图2b、c）。当进水PO43–P为160–400 mg/L时，ARR 和 NRR 分别从0.72和0.90下降到0.45和0.43 kg/(m3·d)，ARE和NRE最终分别下降到50%和35.17%。此外，ΔpH（出水pH-进水pH）值开始急剧下降并在0.2上下波动，间接反映了厌氧氨氧化性能的恶化。从化学计量比也可以得出上述结果，在300-400浓度下，化学剂量比都偏离了理论值（1.32和0.26）（图2e）， ΔNO2–N/ΔNH4+-N和ΔNO3–N/ΔNH4+-N的值分别下降到0.96和0.20。84天时，在SBR中首次发现了白色沉淀物，并随着进水磷酸盐用量的进一步增加而积累。沉积物的XRD（X射线衍射）图显示为磷酸钙镁（Ca7Mg2P6O24）。
出现高浓度磷酸盐抑制MBA脱氮的原因可能是厌氧氨氧化生物膜对磷酸盐比颗粒污泥更敏感，或者磷酸盐沉淀的存在干扰了微生物与底物之间的接触（主要原因）。此外，SBR运行后，出水NH4+-N和NO2–N被完全去除，这说明磷酸盐沉淀物对MAB无毒害作用。
图2. 不同磷酸盐剂量下MAB在158 d内的脱氮性能：(a)底物浓度；(b)去除效率；(c)装载率；(d) pH值变化；(e)化学计量比
2 不同磷酸盐剂量下MAB的脱氮特性
如图3所示，当磷酸盐浓度为0-80 mg/L时，出水NH4+-N几乎完全被去除，NO2–N≤11 mg/L。其中在5-30 mg/LPO43–P期间，去除铵态氮的时间从4h减少到3.5h，同时，出水NO3–N在PO43–P为30 mg/L达到最大值。因此，低剂量的磷酸盐满足了MAB的生长需求并增强了其活性。在50-120 mg/L时，完全去除NH4+-N的时间回到了4 h，可能原因：升高的磷酸盐与厌氧氨氧化酶和底物形成的化合物结合，导致酶活性降低和反应速度变慢，在160–400 mg/L PO43–P时，MAB的脱氮受到严重影响，但在300-400 mg/L PO43–P阶段，NH4+-N转化率高于200 mg/L的阶段，因为其出水浓度并没有显着增加（图3a），NO2–N和NO3–N则依旧随着磷酸盐浓度增加而出水浓度增加，这可能是由于NH4+的吸附。
微生物细胞和EPS由于其负电荷可以吸附阳离子，并在20分钟内达到吸附平衡，运行周期前0.5小时NH4+-N的急剧下降与该结论一致。一般来说，游离金属离子的存在会抑制NH4+的吸附。然而，由于形成磷酸钙镁沉淀，消耗了Ca2+和Mg2+，增强了NH4+的吸附。300-400 mg/L PO43–P时，根据磷酸盐浓度和出水NH4+浓度成正比计算得到理论去除值为65.92和56.85 mg/L，而实际值为83.97和79.79 mg/L，由此计算，相应的吸附百分比分别为21.5%和28.8%。
如图3d所示，ΔNO2–N/ΔNH4+-N 和ΔNO3–N/ΔNH4+-N在前2小时出现不规则波动，然后趋于稳定。然而，在300-400 mg/L时，ΔNO2–N/ΔNH4+-N显著偏离1.32，这与0-50 mg/L时的情况相反。随着磷酸盐浓度的增加，出水pH升高的幅度逐渐变平（图3b），例如400 mg/L时，ΔpH值仅占不添加磷酸盐时的33%。如图3f所示，随着反应时间的延长，底物转化率逐渐降低，在160-400 mg/L阶段，由于磷酸盐沉积物的存在，底物与生物质之间的接触受到阻碍，导致底物转化率较低。因此，在高浓度磷酸盐的存在下，SBR 中MAB的活性会严重恶化。
图3 加入磷酸盐MAB脱氮性能：(a) NH4+-N 浓度；(b) 酸碱度；(c) NO2–N浓度；(d)化学计量比；(e) NO3–N浓度；(f)底物转化率
3 微生物群落变化
通过16S rRNA研究了不同磷酸盐浓度下SBR中微生物群落的变化。三个时间的微生物样品的OTU数量分别为311、300和297，图4a揭示了SBR中的主要微生物：Planctomycetes、Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes和Chloroflexi。其中，含有厌氧氨氧化菌属的Planctomycetes仍处于优势地位，添加磷酸盐后，S1中的Planctomycetes从初始的44.11%加至55.6%，然后在S2中下降至42.61%，属水平上同样。此外，Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes和Chloroflexi的丰富度均由S0的19.36%、11.95%、9.3%和6.53%下降到S1的16.09%、9.31%、4.38%和6.37%，然后上升到S2的19.53%、11.18%、11.59% 和 7.68%。这表明上述4个门与Planctomycetes存在竞争关系，且Planctomycetes是含盐废水中的优势菌种。
在属水平上，Candidatus Scalindua是Planctomycetes中唯一的厌氧菌，其丰富度首先从41.87%增加到50.11%，然后下降到35.43%（图4b）。这表明适当的磷酸盐剂量（PO43–P≤120 mg/L）可以促进MAB的生长，而高浓度的磷酸盐则相反。MAB的减少导致总氮去除效率降低，仅次于Candidatus Scalindua的Actinomarinales的丰度从S0的11.4%变为S1的8.71%并最终维持在10.46%。S0和S2的Wenzhouxiangella的丰富度没有明显变化。Marinicella是一种硫氧化细菌，可以将NO3−-N转化为N2，其在S2中的相对丰度较S0下降了0.6%。在S2 期间，检测到新属Algibacter和Colwellia，丰度分别为5.76%和3.72%，其中Algibacter是从海水中分离出的革兰氏阴性菌，需要 Mg2+才能生长。在整个过程中没有观察到聚磷酸盐积累生物的存在，表明还原的磷仅用于沉淀和细菌生长。
图4 门水平（a）和属水平（b）微生物分布柱状图
同时使用了基于KEGG和COG的PICRUSt 分析功能基因。如图5a所示，碳水化合物代谢的丰度（9.22-9.28%）相对较高，这表明磷酸盐对微生物消耗碳源获取能量没有明显影响。氨基酸代谢、脂质代谢、外源生物降解代谢和膜转运的丰度在S1时下降，然后在S2时上升。相反，能量代谢、辅因子和维生素代谢、信号转导和细胞运动的丰度在S1中较高，在S2中较低。能量代谢丰度的下调表明高浓度磷酸盐抑制了细胞内物质的产生和细菌的生长。这与Candidatus Scalindua丰度的下降是一致的。此外，复制重组和修复（6.71-7.11%）、细胞内运输、分泌和囊泡运输（3.95-4.38%）和细胞运动（3.34-3.79%）的相对丰度在 S1 中上调，在 S2 中下调，这表明高剂量的磷酸盐会破坏微生物细胞，不利于细胞内物质的转运。
图5.基于(a) KEGG和(b) COG 数据库的PICRUSt分析
4 EPS的变化
EPS是一种由微生物分泌的高分子聚合物，可以保护细菌免受外界有毒物质的侵害。一般可分为可溶性EPS（SEPS）、松散结合型EPS（LB-EPS）和紧密结合型EPS（TB-EPS），它们的主要成分是蛋白质（PN）、多糖（PS）和腐殖质。在160 mg/L PO43–P 时，EPS的产量最初从2.74增加到3.66 mg/g 湿重。当磷酸盐浓度超过200 mg/L 时，EPS 的产量急剧增加至11.25，然后降至7.57 mg/g 湿重（图6）。总体而言，与不添加磷酸盐相比，高磷酸盐浓度下EPS的产量增加，这可能与沉淀的形成有关。恶劣的生活环境迫使微生物产生更多的EPS来保护自己免受损害，此外，PN/PS比值在160 mg/LPO43–P时达到最大值16.83，然后随着磷酸盐浓度的增加而降低，这意味着微生物细胞的疏水性降低了。EPS产量的下降可归因于 MAB在有害情况下对细胞内物质的消耗。即由于MAB生物膜被磷酸钙镁沉淀覆盖，内部底物稀少，为了维持生理活动，微生物可以降解EPS以获得能量。而EPS产量的下降不利于MAB抵抗磷的干扰，MAB的活性也有所下降。
图6.不同磷酸盐剂量下EPS含量的变化 PN：蛋白质 PS：多糖
5 磷酸钙镁的形成
如上文所述，流出物中的一部分还原磷以Ca7Mg2P6O24的形式沉积，随着进水磷酸盐用量的增加，生物膜上积聚的白色沉淀物逐渐增多。这可以看作是磷回收的一种手段。至于其他的磷酸盐矿物，如羟基磷灰石（HAP，Ca5(PO4)3(OH)）和鸟粪石（MAP，MgNH4PO4·6H2O），在SBR的厌氧氨氧化生物膜上未检测到，这可能与pH值和SBR中Ca含量有关。
在本研究中，当磷酸盐浓度超过160 mg/L时，氮和磷酸盐的物质平衡被打破，随着KH2PO4用量的进一步增加，进水pH值显著下降。为了使进水pH值保持在7.5，加入氢氧化钠进行酸碱中和。随着氢氧化钠的注入，在液相中观察到白色絮状沉淀。此外，随着磷酸盐用量的增加，所需的氢氧化钠浓度也增加，产生更多的白色絮状沉淀物，这些白色沉积物会粘附在生物膜上并延迟底物渗透到内部生物质中，正是由于这些非织造膜载体的存在，MAB可以富集成致密致密的生物膜，而不是漂浮和松散的颗粒。因此，MAB的新细胞不能以被沉淀覆盖的颗粒为核，形成更大的颗粒。
钙在碱性环境中与磷酸盐结合形成磷酸钙沉淀，然后与镁结合形成Ca7Mg2P6O24。此外，生物代谢产生的内源性有机物可能会诱导磷酸盐生物矿化，但其具体形成机制有待进一步研究。
总结
本研究首次探索了含氮含盐废水中不同磷酸盐剂量下MAB的脱氮工艺。MAB的活性在含低浓度磷酸盐时（0-30 mg/L）增强，高浓度时（160~400 mg/L），NH4+和NO2-的去除率下降，MAB相对丰度下降了15.4%。此外，沉积物的存在迫使微生物产生更多的EPS以保护自己免受损害。通过低浓度磷酸盐促进MAB的厌氧氨氧化过程或对含氮含盐废水脱氮处理有重大意义，SBR中磷酸钙镁沉淀的形成，或许为磷元素的回收提供了思路。
以上论文的测序由北京百迈客生物科技有限公司完成。如您有任何疑问，欢迎讨论区留言或者扫描下方二维码联系我们~
百迈客微生物组一站式服务
百迈客拥有完备的实验分析平台，可以开展宏基因组（Illumina/ONT），二代微生物多样性，全长微生物多样性，细菌/真菌基因组测序及数据分析服务,百迈客在微生物组领域深耕多年，致力于提供高质量的科研服务。目前已搭建微生物多样性分析平台、宏基因组分析平台、微生物基因组和宏基因组binning分析四大平台，助力微生物组研究。
参考文献：
1.Si P, Li J, Xie W, et al. Deciphering nitrogen removal mechanism through marine anammox bacteria treating nitrogen-laden saline wastewater under various phosphate doses: Microbial community shift and phosphate crystal[J]. Bioresource Technology, 2021, 325: 124707.
京公网安备 11011302003368号