英文题目：Fungal lysozyme leverages the gut microbiota to curb DSS-induced colitis
发表杂志：Gut Microbes
影响因子：10.302
发表时间：2021年10月25日
导读
结肠炎的主要症状是结肠炎症和肠道健康受损，这两种特征都会加剧肥胖和胰岛素抵抗。宿主防御肽(HDPs)是肠道稳态的关键调节因子，在上述情况下通常会出现故障。溶菌酶是一种来自A.alcalophilum特征良好的HDP，本研究的目的在于通过每日口服溶菌酶来改善饮食诱导的肥胖和化学诱导（DSS诱导）的结肠炎的肠功能。
对低脂饮食（LFD）和高脂饮食（HFD）的小鼠，每日灌胃溶菌酶12周并设置对照组，然后进行代谢评估和结肠微生物群侵入评估。为了进一步评估溶菌酶在肠道炎症的疗效，在DSS诱导的常规小鼠和微生物群缺失小鼠的结肠炎期间，对其补充溶菌酶，通过16S扩增子测序评估了两种模型中纵向微生物组的改变。
研究发现溶菌酶可剂量依赖性地减轻DSS刺激小鼠的肠道炎症，可通过黏液的产生抑制HFD诱导的微生物群侵犯或易位，并可预防空腹高胰岛素血症。同时研究也发现溶菌酶保护肠道健康依赖于一些复杂的肠道菌群。
在HFD和DSS两种模型中，Akkermansia muciniphila都与肠道健康受损有关，而溶菌酶可以缓解这种情况，同时，PICRUSt2功能预测结果也显示溶菌酶给药会持续影响一些特定途径。
总的来说，该研究表明A.alcalophilum来源的溶菌酶是一个非常有应用前景的促进肠道健康的候选物质。
材料与方法
实验材料：
C57BL6/J小鼠适应低脂参考饮食（LFD）和高脂参考饮食（HFD）后，每日灌注溶菌酶，之后进行代谢评估和结肠微生物群侵蚀评估。
为了进一步评估这种溶菌酶对肠道炎症的疗效，研究者接下来对DSS诱导的常规小鼠或微生物耗尽的BALB/c小鼠补充溶菌酶。
6周龄的雄性C57BL6/J小鼠或雌性BALB/c小鼠进行2周饮食适应后：
● C57BL6/J小鼠部分转为高脂饮食（HFD），其余保持低脂饮食（LFD）；口腔灌胃溶菌酶和对照物，处理至第12周；
分组：HFD+Lyso；HFD+Vehicle；LFD+Lyso；LFD+Vehicle
● BALB/c小鼠：DSS诱导分组：Lyso组，Vehicle组；微生物区系耗尽小鼠分组：Lyso组，Vehicle组。
主要方法：
生理生化实验、组织细胞因子定量、qPCR、FISH、16s rRNA基因扩增子测序、组织病理分析
主要研究结果
1. 溶菌酶可以缓解饮食诱导的空腹高胰岛素血症，增加黏液的产生，减少其它微生物群的侵蚀
该文章首先研究了溶菌酶对饮食诱导型肥胖小鼠的潜在影响。研究结果发现，与喂食LFD的小鼠相比，喂食HFD的小鼠体重增加了更多，每天补充溶菌酶对身体成分或能量摄入没有产生可测量的影响（图1a），然而，接受溶菌酶治疗的小鼠确实表现出了更低的空腹胰岛素水平（图1b）。与Vehicle+HFD组相比，溶菌酶更倾向于降低餐后血糖而不是空腹血糖。葡萄糖刺激的胰岛素浓度不受溶菌酶补充的影响。与已知可以调节肠道渗漏的空腹胰岛素减少类似，本文研究者们在溶菌酶灌胃的动物中观察到HFD诱导的肠道通透性出现数值保护（图1e）。这些体内迹象表明HFD喂养的小鼠肠道通透性增加，且循环LPS、肠炎症以及与结肠和回肠紧密连接基因的表达在组间保持相似。尽管如此，溶菌酶还是使HFD诱导的结肠中Tlr2表达的减少维持在正常范围内（图1f）。根据已有研究显示，TLR2的激活与结肠杯状细胞的黏液调节有关，因此本文研究者们调查了黏液的产生，发现补充溶菌酶可防止HFD诱导的结肠Muc2下调（图1g）。进一步的，发现这种溶菌酶介导的黏液完整性保存，可能是由于肠上皮细胞到最近细菌的平均距离增加6倍以上导致，从而说明补充溶菌酶足以防止HFD引起的微生物区系侵蚀（图1h-i）。
图1. 溶菌酶降低C57BL6/J小鼠中与Tlr2和Muc2表达相关的空腹胰岛素水平。
2. 溶菌酶逐步改变肠道微生物群组成及其预测功能
由于微生物区系侵蚀的减少也可能由于溶菌酶具有潜在的杀菌活性，因此本文研究者接下来评估了实验小鼠粪便微生物群的纵向变化。在研究开始时，所有的小鼠都低脂喂养，且微生物组成分析显示这些小鼠的微生物组成具有相似性。HFD喂养导致了小肠和粪便样本中的微生物群组成产生了巨大差异（图2a-d）。纵向抽样显示，饮食干预导致粪便微生物群发生即时变化，而溶菌酶给药的影响逐渐显现。与其他组相比，每天接受口服溶菌酶的小鼠，其微生物群落在结构上表现出独特和渐进的轨迹（图2c）。但尽管如此，除在小肠中，一些HFD诱导的粪便微生物变化可以通过补充溶菌酶来抵抗（图2a-f）。微生物群的alpha多样性不受溶菌酶给药的影响，说明该溶菌酶没有相应明显的抗菌作用。与vehicle组小鼠相比，接受溶菌酶的小鼠粪便中大量细菌ASVs的相对丰度被修饰了，且受调控的ASVs大多属于厚壁菌门，其中Akkermansia muciniphila和Oscillospira（颤螺菌属）减少，胃瘤胃球菌属的一种未分类的胃瘤胃球菌、假长双歧杆菌和异歧杆菌的相对丰度则增加（图2e）。此外，由于补充了溶菌酶，4个细菌属显示在整个属水平都发生了ASVs丰度改变（图2f），而其它的ASV修饰则呈现出物种依赖性。接下来，本文研究者们对细菌群落进行了功能预测，结果显示接受溶菌酶的小鼠粪便样本菌群预测功能发生了显著变化，而小肠样本中则没有显著变化（图2g和图3f）。
图2. 溶菌酶影响HFD喂养C57BL6/J小鼠的肠道微生物群组成和预测功能
图3. 剂量依赖性溶菌酶可以防止DSS诱导的BALB/c小鼠结肠炎
3. 溶菌酶剂量依赖性地预防DSS诱导的结肠炎
为了进一步研究补充溶菌酶对肠道健康的有益效果，本文中研究者们评估了化学诱导（DSS诱导）的轻度结肠炎中的结肠损伤。设置了两种剂量（1.0mg和0.4mg）的溶菌酶。在体重方面，发现接受1.0mg溶菌酶在对DSS诱导的小鼠的有一定的保护作用（图3a-b），而0.04mg剂量的溶菌酶虽然缺乏保护作用，但是仍能抑制肠道炎症（图3c-h）。研究者还在所有测量数据中观察到一个高度一致的剂量依赖性趋势（图3a-h）。与对照组小鼠相比，1.0mg溶菌酶没有引起结肠损伤或细胞因子水平的可测量变化，因此表明溶菌酶不影响健康小鼠的免疫稳态（图3c-h）。
4. 溶菌酶可以在一定程度上保护DSS诱导的微生物区系变化，并改变其预测功能
DSS诱导前，溶菌酶补充组和对照组的粪便微生物组成相似（图4a）。而处理后（研究末期），研究者评估了回肠、盲肠和结肠中的肠道微生物组成，发现与已发表研究结果一致，这些部位的微生物群落结构发生了明显的变化（图4b）。与DSS诱导结肠炎的结肠靶点一致，DSS刺激诱导了远端肠道的一致变化，但在回肠中只有轻微的变化（图4b-c）。溶菌酶可以在一定程度上保护肠道微生物免受到DSS的影响（图4b-c），对DSS相关的轨迹起到了保护作用，在Prevotella属和Oscillospira属中，被归类为A. muciniphila的几种ASV普遍减少，而研究者也观察到R. gnavus的增加，从而使DSS刺激小鼠中的溶菌酶介导的改善情况与在HFD喂养小鼠中观察到的特征相一致（图4c-d）。肠道微生物群的预测功能与微生物群组成相似，在结肠样本也是主要受溶菌酶的影响（图4e和4k）。该研究确定了在HFD和DSS两项研究中都存在的21条受调控的通路，其中13条均受到溶菌酶的调控。这些途径持续影响与氨基酸和核苷酸/核苷相关合成，碳水化合物代谢的改变，以及涉及肽聚糖合成和成熟的三种不同的途径。
图4. 溶菌酶可一定程度上保护DSS对BALB/c小鼠微生物群组成的影响
5. 溶菌酶介导的缓解DSS诱导性结肠炎依赖于功能性的肠道微生物群
为了进一步研究肠道微生物群在溶菌酶介导的保护中所发挥的作用，探寻溶菌酶与微生物的关系，研究者设计添加了微生物群耗尽小鼠的研究组，这类小鼠的症状与DSS诱导的肠道损伤类似。尽管研究结果显示受DSS刺激的Vehicle组的小鼠体重没有减轻，但出现了与之前观察结果相似的结肠炎表型(图5a-c)。每日溶菌酶补充对DSS诱导的结肠缩短和脾脏重量以及宏观和微观下的结肠炎评分都有很强的保护作用(图5a-g)。重要的是，虽然抗生素本身并不足以在体外抑制溶菌酶的活性，但在微生物区系耗尽的小鼠中，溶菌酶并没有发挥保护作用（图5h-n），这些数据很明显地说明，溶菌酶对结肠炎的影响依赖于肠道微生物群。
图5. 溶菌酶利用肠道微生物群来缓解DSS诱导的BALB/c小鼠结肠炎
总结与结论
总而言之，通过16s扩增子测序结合其它病理与生化实验以及结肠炎症状，初步证实了A. alcalophilum来源的溶菌酶重塑了肠道微生物群组成及其预测功能，减少HFD诱导的肠道通透性和细菌入侵，以微生物和剂量依赖性地方式减少DSS诱导的结肠炎，该文章研究了此来源的溶菌酶对两种不同品系的小鼠的有益影响。结合已发表的免疫调节特性，说明溶菌酶在改善肠道健康方面值得进一步研究以评估其临床转化的前景。
图6 溶菌酶在HFD喂养的C57BL/6J小鼠和DSS诱导的结肠炎BALB/c小鼠中的作用
参考文献
1. Larsen, Ida Søgaard et al. “Fungal lysozyme leverages the gut microbiota to curb DSS-induced colitis.” Gut microbes vol. 13,1 (2021): 1988836.
doi:10.1080/19490976.2021.1988836
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