快速克隆基因（三）

上一篇文章与大家分享了Positionalcloning 2.0 怎样避免在基因克隆上花费10年？随着高通量测序技术的发展，“核酸”检测手段越来越精准，百迈客自2009年成立以来，一直与大家一起目睹此过程并不断成长，基于高通量测序平台和博士为主的研发团队，开展了对群体、转录调控、医学、基因组、微生物等研究的主体业务：

❖ 当基因组检测不是制约基因克隆的主要问题，表型鉴定逐步演变为基因克隆的新瓶颈。

在过去几年，基因组在基因克隆方面的飞速进展，基于突变体，涌现出快速且低成本的基因定位方法。也迎来：如何在成千个突变材料中将感兴趣的表型植株挑选出来的挑战。同时，基因功能的冗余也为多倍体筛选突变体造成一定阻力，一般一个基因在植株中作用明显，突变后产生的表型差异越大，这样的会容易被鉴定。而很多重要的农艺性状，例如谷物产量，耐旱性或抗病性等属于数量性状，由很多微效位点一起加效起作用，如果表型还和环境存在互作，这些无外乎都对去寻找它们的突变体克隆基因形成了障碍。例如Lr34，Lr46和Lr68是植物中抗叶锈病相关基因，在世界大多数地方，Lr34和Lr46比Lr68有更大的表型效应，而在乌拉圭和阿根廷，Lr68表现出三者间最强的表型效应，所以在克隆Lr68时要考虑环境对表型影响。理论上，合适的环境中的表型考查，可以将目标QTL的贡献率提到最大化。

过去的十年中，测序，基因组复杂性降低，标记开发和基因组分析加速了谷物基因的克隆。同时表型检测系统也有了较快的发展，可以综合自动化控制、光学成像、图像分析及计算机技术等多种现代科学技术，表型组学研究可追踪分析基因型、环境与表型的关系。基于图像技术，可在稳定一致的环境下，定量，准确，无损地获取植株表型，除了可对产量、抗性等复杂性状进行动态测量外，还可获得人工无法测量的新性状如植株密度、谷粒投影面积等，另外随着代谢组的发展，也为我们带来了形形色色的表型数据。

❖ 基因克隆，未来何去何从？

随着谷物基因组的发布，基因组学研究最终走向后基因组时代，大米，高粱，玉米，大麦和小麦的基因组被公布，这为开发分子标记，进行图位克隆提供便利，下个目标将会是综合的分析不同种质资源间的变异，包括单核苷酸变异，拷贝数变异，和结构重组等。举个例子，2018年高质量的野生稻和栽培稻的基因组、3000份水稻重测序被公布，这是水稻中首次基于上千份品种的基因序列多样性及结构研究。类似的研究在小麦和大麦中开展，基于整个品种的变异检测，可以用于TILLING群体或MutRenSeq的测序的捕获序列设计，另外，数以千份的的重测序数据将更有利于GWAS研究，例如：Arora等选取174Ae. tauschii ssp.strangulata材料和21份Ae. tauschii ssp. tauschii材料，基于AgRenSeq的K-mer分析，成功地鉴定出了Sr33，Sr45，Sr46和SrTA1662基因。

另外，可以预期的是测序技术的读长和准确性在不久的将来会进一步改进，例如，最近拟南芥的高质量基因组公布，利用MinIONNanopore组装出包含62个contigs，N50为12.3Mb，总长为111Mb基因组且大大降低测序成本，百迈客全新引进2台ONT高通量测序仪PromethIONNanopore结果也是杠杠的：

PromethION下机数据（部分）

注：Species：分析的物种信息；SeqNum：各个长度范围内序列的数目；SumBase：指各个长度范围内序列的总长度；N50Len：reads N50长度；N90Len：readsN90长度；MeanLen：平均reads长度；MaxLen：最长reads长度；MeanQual：质量值。

我们前期的研究主要基于孟德尔遗传定律，大多涉及的是质量性状和数量性状的主效位点，而好多重要的农艺性状如产量及花期，微效QTL及它们间的互作发挥了重要作用，当然，在前期做完QTL或GWAS研究之后，图位克隆仍是定位数量性状相关基因的方法。

例如，GWAS和图位克隆的组合，定位水稻中的抗性基因bsr-d1。微效基因的克隆障碍主要因为它们对表型的贡献率较小，这样基于极端表型和突变体的MutMap或MutChromSeq方法并不适合于它，后期相关基因的克隆绝大部分取决于精准的表型鉴定。

总之，在过去5年里，基因组研究的进步彻底改变了基因克隆的时速，一个全面的克隆基因的目录，以及它们功能多态性，可以大大提高基因组辅助育种的准确性。

 

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