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英文名称：N6-methyladenosine reader IMP2 stabilizes the ZFAS1/OLA1 axis and activates the Warburg efect: implication in colorectal cancer
中文名称：N6-甲基腺苷（m6A）阅读蛋白IMP2能稳定ZFAS1/OLA1轴并激活沃伯格效应：在结直肠癌中的意义
杂志名称：J Hematol Oncol.
影响因子：17.233
摘要
背景：越来越多的证据表明N6-甲基腺嘌呤（m6A）调节因子有助于结直肠癌（CRC）的病因学和进展研究。然而，参与糖酵解代谢的m6A阅读蛋白的确切机制仍然模糊不清。本文旨在将m6A阅读蛋白与糖代谢串联起来，揭示一种CRC进展的新机制。
方法：通过生物信息学、ISH和IHC检测，分析了候选lncRNA和m6A阅读蛋白之间的关系。利用体内和体外研究（包括MTT、CFA、反式孔、细胞凋亡、免疫印迹、qRT-PCR和异种移植小鼠模型）来探讨这些指标的生物学功能。利用乳酸检测、ATP活性检测和ECAR检测验证其下游靶点的生物学功能。利用生物信息学、RNA稳定性、RIP实验和RNA下拉实验探索其潜在的分子机制。
结果：本文发现在CRC增殖和进展过程中，m6A阅读蛋白IMP2与长链非编码RNA（lncRNA）ZFAS1以依赖m6A调节的方式进行串联，随后增强了OBG-样ATPsae1（OLA1）和腺嘌呤三磷酸（ATP）水解和糖酵解的募集。
材料方法
实验样本：144对CRC组织和对应的癌旁组织；CRC细胞系和正常人肠道上皮细胞系
实验方法：lncRNA-mRNA芯片测序，qPCR，WB蛋白印迹分析，组织微阵列（TMA）和免疫组化（IHC），lncRNA ISH检测，细胞增殖实验，细胞克隆实验（CFA），细胞凋亡检测，细胞迁移实验，免疫荧光实验（IF），m6A斑点实验，RNA稳定性测定， RNA下拉实验 ，RIP-PCR检测，ATP含量检测，LD含量检测，ATP酶活性检测，细胞外酸化速率测定（能发高分文章的秘诀）。
结果
1、CRC细胞和组织中lncRNA的失调与IMP1/2/3的表达相关
在CRC组织中，只有IMP2表达量比较高，且远高于IMP1和IMP3（图1b）。同样发现IMP2在7个CRC细胞系（(LOVO，CACO2，SW48，SW480，HT29，HCT116和 SW620)中的表达量也高于结直肠上皮细胞中的表达量（图1c）。而m6A斑点实验检测结果表明，总m6A在CRC细胞系（特别是HCT116、SW620和HT29细胞系）中的水平要高于正常结直肠上皮细胞（图1d）。这和之前对IMP2的功能研究结论一致，即稳定RNA的表达，增加总RNA的m6A水平。
然后分析了m6A阅读蛋白IMP1/2/3的RNA免疫沉淀测序（RIP-seq)数据以及TCGA中的数据，获得了7个候选的lncRNA。其中ZFAS1、SNHG15和CRNDE表现出明显的高表达（图1e）。在CRC细胞中，ZFAS1表现出最明显的高表达（图1f）。在IMP1/2/3和ZFAS1之间计算相关性，发现ZFAS1和IMP2之间存在明显的正相关（图1g）。
为了研究IMP2在ZFAS1表达中的潜在作用及其相关的m6A甲基化水平，本文进行了组织微阵列（TMA）、RNA原位杂交（ISH）和免疫组化（IHC）检测，分析CRC组织样本和对应的癌旁组织（n=144）中IMP、m6A和ZFAS1的表达（图1h）。值得注意的是，在CRC组织中，IMP2、ZFAS1的表达和m6A的甲基化水平急剧增加（图1i）。进一步进行相关模式分析，表明IMP2和ZFAS1的表达和m6A水平呈现正相关性（图1j）。
为了进一步探讨这些指标在队列中作为独立预后因素的临床效用，对144例CRC组织和癌旁组织进行了秩和检验和多变量cox回归分析，发现IMP2表达量的升高显著缩短了总生存期（OS）和无病生存期（DFS），m6A甲基化的高表达与不良的OS和DFA显著相关，而ZFAS1表达量高的CRC患者的OS急剧下降。DFS也明显下降（图1k）。说明IMP2、m6A和ZFAS1的表达与CRC患者的生存状况有着明显的相关性。
总之，这些结果表明IMP2在CRC细胞和组织中高表达，并伴随着相关的m6A甲基化水平和ZFAS1的表达。这些指标也表示了其作为独立的预后预测因子的潜在功能，可用于未来的CRC评估和治疗的生物标志物。
图1（上下滑动查看）
2、CRC细胞中IMP2通过直接与ZFAS1的m6A位点结合促进ZFAS1的稳定性
为了探索在CRC肿瘤发生发展过程中，IMP2介导的m6A甲基化稳定性及其相关的ZFAS1表达的关键生物学特征，在HCT116和SW620细胞系中检测干扰IMP2后的IMP2和ZFAS1的表达。结果表明异位IMP2的表达明显地增强了ZFAS1和IMP2的表达。然而通过qPCR定量分析发现IMP2的敲除抑制了HCT116和SW620中ZFAS1和IMP2的表达（图2b）。在IMP2敲除的CRC细胞中，通过上调ZFAS1的表达来进行拯救实验，通过qPCR发现ZFAS1的表达的确得到了恢复（图2c）。更重要的是，RNA稳定性分析进一步确定了与空载体处理的细胞相比，IMP2敲除或在不同时间点(0,2,4,6 h)进行放线菌素D治疗的HCT116和SW620 细胞中ZFAS1 RNA的半衰期是减少的（图2d）。这些发现说明IMP2作为一个m6A阅读蛋白对ZFAS1有稳定作用。
为了验证IMP2和ZFAS1之间的直接关联，初步分析了FLAG标记的IMP1/2/3的RIP-seq数据，发现和对照相比，异位IMP2的表达极大地丰富了HEK293T细胞的内源性ZFAS1（图2e)。此外，RNA结合蛋白的数据说明IMP2蛋白有一个特定的结合域可以识别ZFAS1中的m6A motif（图2f）。为了进一步验证IMP2和ZFAS1结合位点的可靠性，进行了共定位的ISH和免疫荧光（IF）检测，结果发现ZFAS1和IMP2的表达分布相一致，主要结合位点在HCT116和SW620的细胞质中，部分在细胞核中（图2j）。RIP分析发现相比对照组，用m6A抗体富集得到了更高表达的ZFAS1（图2k），RNA下拉实验说明了通过携带m6A motif与IMP2蛋白特定结构域可以直接结合（图2m）。利用qPCR验证IMP2 KH3-4的WT和Mut载体处理后的HEK293T细胞中ZFAS1的表达，发现表达量显著减少（图2i），说明IMP2 KH3-4结构域可以与ZFAS1直接相互作用。
以上数据结果说明IMP2通过KH3-4直接与ZFAS1上的m6A位点结合，并增强了ZFAS1的稳定性（图2a）。
图2（上下滑动查看）
3、IMP2通过调节ZFAS1在CRC细胞中的表达来调控生物学特性
为了进一步明确在CRC细胞中IMP2和ZFAS1特异性的调控模式，首先通过MTT实验（图3b）和细胞克隆实验（CFA）（图3c）分析了干扰IMP2表达后的HCT116和SW620细胞系的细胞增殖能力和细胞克隆能力。结果发现异位IMP2的表达显著促进了CRC细胞的生长和克隆能力，而IMP2的耗竭抑制了CRC细胞的增殖。此外还检测了细胞侵袭能力（图3d），发现在沉默IMP2时，细胞的迁移受到了明显的抑制，而IMP2的过表达极大地提高了HCT116和SW620细胞系的侵袭能力。还发现IMP2的敲除增加了CRC细胞的凋亡率，IMP2的过表达会抑制CRC细胞的凋亡率（图3e）。后续通过拯救实验表明ZFAS1的过表达逆转了对CRC细胞的促进作用，包括细胞增殖能力、细胞克隆能力、细胞迁移能力和细胞凋亡率（图3f-i）。
这些结果说明IMP2通过促进ZFAS1的稳定性和表达来增加CRC细胞的增殖，抑制CRC细胞的凋亡，并促进细胞侵袭和转移，而IMP2对细胞表型的影响可以通过调节ZFAS1的表达来恢复。
图3（上下滑动查看）
4、在CRC细胞中鉴定到OLA1是IMP2稳定的的ZFAS1的关键靶点
为了进一步挖掘影响CRC细胞表型和功能的ZFAS1的下游靶点，在CRC细胞中进行了相关的功能研究。首先通过热图分析发现了与ZFAS1过表达正相关的潜在下游靶点，并通过公开数据集进行验证（图4a，b)。交集结果中发现了线粒体能量代谢相关基因OLA1，进一步通过qPCR检测发现与对照细胞相比，OLA1在7个CRC细胞系中显著过表达（图4c）。同样在CRC组织和癌旁组织的qPCR结果中发现，OLA1的表达在CRC组织中更高（图4d）。结果说明OLA1在CRC的组织和细胞样本中都是高表达的，且OLA1和ZFAS1的表达模式高度一致。
随后采用TMA和IHC检测OLA1的表达（图4e），通过RCO曲线评估OLA1的低/高表达，发现与对照组相比，CRC组织中观察到明显的OLA1表达，表现出致癌基因的特性（图4e，f）。且OLA1与ZFAS1的表达存在正相关性（图4g）。与临床数据做相关性分析，结果表明OLA1低表达的患者占比较高（图4h），OLA1高表达的CRC患者的DFS和OS时间明显缩短了（图4i）。后续针对OLA1是否是ZFAS1的下游靶点做验证，IMP2沉默/过表达不仅降低/增加了OLA1 mRNA的表达，而且降低/增加了OLA1蛋白的表达。但是IMP2对OLA1的影响可以被ZFAS2完全逆转（图4j-l）。
这些发现表明在CRC细胞和组织中，OLA1受到被m6A修饰和m6A稳定的ZFAS1表达的正向调控，进一步的预后评估揭示OLA1可以成为预测CRC临床结果的一个潜在生物标志物。
图4（上下滑动查看）
5、ZFAS1通过与OLA1的OBG型功能域结合增强OLA1的活性并激活糖酵解代谢
接下来通过ISH和IF实验证明ZFAS1和OLA1在CRC细胞中的共定位。结果表明，OLA1和ZFAS1不仅持续分布在HCT116和SW620细胞系的细胞质中，而且还分布在细胞核中（图5b）。为了确定ZFAS1是否与OLA1有直接的结合位点，并研究ZFAS1中关键的m6A位点对OLA1的影响，本研究将ZFAS1的三个A碱基替换成U碱基，并重新预测了
ZFAS1的三级结构。有趣的是，ZFAS1-WT和ZFAS1-Mut都是与OLA1的OBG型功能域结合，而且ZFAS1-WT和OLA1的结合强度远远高于ZFAS1-Mut和OLA1的结合强度（图5c）。RNA下拉实验表明，ZFAS1-WT的探针能显著下拉OLA1，而当ZFAS1的m6A位点发生突变时，ZFAS1-WT不能再下来OLA1（图5d）。所有结果说明OLA1蛋白特异性结构域能和含有ZFAS1-OLA1结合motif之间有直接结合作用。此外，OLA1表达的减少导致其ATP酶活性的降低，而ZFAS1的过度表达可以恢复OLA1的ATP酶活性。但是当ZFAS1的关键m6A位点发生突变时，ZFAS1对OLA1的ATP酶活性的恢复作用也消失了（图5e）。这也证明了ZFAS1对OLA1的ATP酶活性的促进作用取决于ZFAS1和OLA1的结合。
接下来探索OLA1的ATP酶活性的变化对CRC细胞能量代谢的影响，研究了HCT116和SW620细胞系中乳酸和ATP的含量。发现OLA1表达的减少不仅可以降低乳酸的积累，还可以减少细胞中ATP的含量（图5f，g）。通过细胞外酸化率的测定检测OLA1的变化对CRC细胞的糖酵解代谢能力的影响，发现OLA1表达的减少可以显著降低CRC细胞的糖酵解代谢能力，ZFAS1-WT可以恢复OLA1表达减少对CRC细胞糖酵解代谢能力的影响（图5h）。
总之，ZFAS1可以直接与OLA1的OBG型功能域结合，从而增强OLA1的ATP水解能力，促进乳酸的积累，激活了CRC细胞的糖酵解途径，最终促进CRC能量的释放（图5a）。
图5（上下滑动查看）
6、IMP2-ZFAS1-OLA1信号轴影响到线粒体能量代谢
通过电子显微镜观察到IMP2沉默后线粒体形态发生变化，即发现CRC细胞中线粒体明显肿胀和受损，IMP2沉默后线粒体的形态回复正常（图6b）。同时IMP2的过度表达促进了HK2（糖酵解的关键蛋白）的表达，抑制了PDHA1（氧化磷酸化的关键蛋白）的表达（图6c）。然而ZFAS1沉默/过度表达和IMP2过表达/沉默后，HK2和PDHA1的表达水平得到恢复（图6d）。
IMP2的过度表达明显增强了乳酸和ATP的释放，还发现IMP2敲除导致乳酸和ATP含量的释放大幅度减少，而ZFAS1可以完全逆转IMP2的影响（图6e，f）。细胞能量代谢检测进一步表明IMP2沉默减弱了细胞的糖酵解代谢能力，而ZFAS1可以逆转IMP2沉默对糖酵解水平降低的影响（图6g，h）。
总而言之，这些发现表明IMP2以依赖m6A的方式稳定ZFAS1的表达，与OLA1介导的线粒体能量代谢有着重要的联系。
图6（上下滑动查看）
7、IMP2在体内通过稳定ZFAS1促进细胞增殖
利用异体移植模型验证IMP2-ZFAS1-OLA1信号轴在体内的生物学功能（图7a），预后评估显示异种移植小鼠在与shIMP2和ZFAS1载体共同转染后，生存时间明显缩短（图7b），表明IMP2和ZFAS1在CRC预后评估中具有协同作用。此外，转染shIMP2载体的异种移植小鼠中，肿瘤体积、大小和重量都明显减少；然而，在与shIMP2和ZFAS1载体共同转染后，肿瘤体积、大小和重量急剧增加（图7c-e）。实验结果说明在异种移植模型中，ZFAS1的过表达明显地逆转了IMP2沉默对肿瘤生长的抑制作用（图7f）。
总之，体内实验表明，通过利用m6A诱导的稳定性的IMP2与ZFAS1/OLA1轴的相互作用，IMP2敲除抑制了异种移植模型的肿瘤生长和恶化。
图7（上下滑动查看）
结论
本文揭示了IMP2-ZFAS1-OLA1信号轴在CRC肿瘤的发生发展中的新调节机制。在CRC细胞中，IMP2正向调节lncRNA ZFAS1。异位IMP1增强了ZFAS1的稳定性和表达，而敲除IMP2会抑制ZFAS1的表达。基于RNA识别的motif，IMP2蛋白的KH3-4结构域在功能上被认为是直接与RNA结合的结构域，促进了ZFAS1中+843 m6A位点的RNA识别。此外，ZFAS1直接与OLA1结合，增强了OLA1的ATP酶活性，介导了线粒体的能量代谢，包括ATP水解和糖酵解代谢的生物过程，并最终影响到CRC细胞命运。总的来说，本文在结直肠癌预防和治疗中发现了一个新的信号轴，即识别到新的靶点和将m6A表观遗传修饰与线粒体能量转换串联起来。
图8（上下滑动查看）
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参考文章：
Lu S, Han L, Hu X, et al. N6-methyladenosine reader IMP2 stabilizes the ZFAS1/OLA1 axis and activates the Warburg effect: implication in colorectal cancer. J Hematol Oncol. 2021;14(1):188. Published 2021 Nov 7. doi:10.1186/s13045-021-01204-0
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