目前,微生物多样性研究主要是于编码核糖体RNA的核酸序列保守区进行的。细菌主要是基于16S区,真菌主要基于18S区或ITS区(内转录间区),16S rDNA 是编码原核生物核糖体小亚基rRNA(16S rRNA)的DNA序列,18S rDNA是编码真核生物核糖体小亚基rRNA(18S rRNA)的DNA序列,ITS是编码真核生物核糖体小亚基rRNA的DNA内转录间隔区序列。这些序列中既有保守区又有可变区,保守序列区域反映了生物物种间的亲缘关系,而高变序列区域则能体现物种间的差异。由于18S rDNA在进化速率上比较保守,在系统发育研究中较适用于种级以上阶元的分类。
常用作微生物分类研究的ITS分为ITS1和ITS2两种。ITS1位于真核生物核糖体rDNA序列的18S和5.8S之间,ITS2位于真核生物核糖体rDNA序列5.8S和28S之间。由于ITS区在核糖体RNA加工过程中被剪切掉,不发挥功能作用,在进化过程中选择压力较小,进化速率约为18S rDNA的10倍,属于中度保守的区域,利用它可研究种及种以下的分类阶元。另外,也可通过选择引物同时扩增18S rDNA和ITS,通过分析20S rDNA序列,先在较高级别上确定样品的归属,然后根据ITS 序列,将真菌归类到种或亚种水平。
微生物多样性测序分析内容
标准分析内容
序列优化及质控、测序数据介绍、数据过滤及质量评估、划分OTU、OTU生成、OTU聚类结果统计、OTU丰度统计、分类学分析、物种分类与相对丰度统计、群落结构分析、物种热图分析(N≥3) 物种系统进化分析、单样品分类学树状图、多样品分类学树状图、单样品(alpha)多样性分析、α-多样性指数统计、稀释性曲线 Shannon-Wiener曲线、物种累积曲线(N≥5) 样品间OTU比较(Venn图或者花瓣图) 多样品(beta)多样性分析(N≥3) Binary jaccard、bray Curtis (un)weighted unifrac(细菌)、样品热图分析、主坐标PCoA分析、主成分PCA分析、样品层次聚类(UPGMA)、NMDS 分析
高级分析内容
组间差异分析(分组≥2,每组≥2样品)、LEfSe分析 组间显著性差异分析、样品间相关分析(N≥3)、三元相图(N≥3)、Anova方差分析(分组≥2,每组≥2样品)、Wilcox秩和检验(分组≥2,每组≥2样品)、RDA/CCA 分析(属水平)(注:需要提供环境因子数据,且环境因子数小于分析样品数) 基于16S的COG和KEGG数据库功能富集(限细菌)
物种相对丰度计算方法
每个物种在每个样品中的测序tags数除以对应样品的测序tags总数