分类： 转录组测序
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英文名: Integrated transcriptome, proteome and physiology analysis of Epinephelus coioides after exposure to copper nanoparticles or copper sulfate

杂志：Nanotoxicology，2017

影响因子：6.248

研究背景

近年来，纳米铜粒子(cu-nps)在日常消费品以及电子、医疗、生物科学等行业中的应用随着纳米技术的迅速发展而不断增加。尽管预计纳米技术产品的范围扩大将带来明显的好处，但对其在海洋环境中的影响及其与水生生物群的可能相互作用的了解并不多。铜纳米粒子可在水生生物中积累，并转移到更高的营养水平，对动物和人类健康构成危害。常规生物标志物（例如抗氧化酶，脂质过氧化，金属硫蛋白，DNA损伤）被证明是敏感的评估Cu-NPs毒性作用的指标。尽管如此，可能有更多的特定基因和蛋白质可有效评估纳米颗粒特异性生物反应。转录组学和蛋白质组学应用于纳米毒理学可能有助于了解不同类型Cu污染物在水生生物中的主要毒性机制和作用模式，并帮助确定纳米颗粒暴露和影响的新颖和无偏见的生物标志物。转录组和蛋白质组可能提供了一个洞察分子机制潜在Cu诱导鱼类反应，并且可能是一种有效的方法识别新蛋白质以及评估生态风险。

Epinephelus coioides（橙斑石斑鱼），一种原生型雌雄同体的海洋鱼类，在中国广泛流行，因为其优良的肉质使其具有很高的商业价值。目前，E. coioides主要在漂浮网箱养殖，在自然环境中很容易就可以受环境污染影响。本研究结合生理分析，转录组和蛋白组分析研究纳米铜或硫酸铜暴露下石斑鱼体内蛋白及基因的差异变化。

材料和方法

取样部位为鱼肝脏，主要进行转录组学，蛋白组学（iTRAQ）及生理实验

  • 粒子表征分析

将纳米颗粒分散在超纯水，制备出含1.0 g Cu-1的铜离子溶液。用透射电镜(tem，jeol jem-2100，日本东京)和纳米粒子追踪分析(nta，Nanosight lm 10)对其粒径进行表征研究。

  • 实验处理及死亡率评估：

石斑鱼被暴露在不同浓度(1.6，1.6，2.4，3.7，5.8或9.0毫克的cu l 1)的cu-np中。这些浓度是根据初步实验选择确定。在暴露期间，鱼不被喂食，死鱼被移除。急性暴露时间持续24小时，并在结束时评估鱼的死亡率。

  • 取样：

用1毫升肝素化注射器从尾静脉抽取血液进行生化分析，取出肝脏，用生理盐水(盐度8.6‰w/v，4c)清洗和冲洗脂肪，然后立即将肝脏冷冻在液氮中进行后续分析（蛋白组和转录组分析）。为便于组织学观察，分别从每个复制的剩余鱼中提取肝脏(左叶)样本，并在10%v/v缓冲液中固定。

  • 脂肪含量和脂肪酸组成分析通过GC/MS进行检测。

研究结果

1、Cu-NPS的特性

Cu-NPS呈颗粒状，呈团聚状，海水中的平均粒径(205±83 nm)大于实验主要的粒径(95±30 nm)。（见下表）

24小时后，Cu-NPs在海水中释放后可溶性Cu为0.02毫克Cu L 1（Cu的初始质量的0.83％），（补充材料，图S1）。X射线衍射表明Cu在海水中24小时后被氧化。

2、存活率和组织学观察

暴露于cu-nps或硫酸铜可导致石斑鱼存活率呈浓度依赖性下降。cu-nps处理下LC 50值为4.8 mg cu l -1，硫酸铜为5.8 mg cu l -1 (图1(A))。在cu-nps浓度为2.4 mg cu l -1下使死亡率达到20%，验证了图1(A)所建立的模型。

组织学观察显示正常肝窦和血管系统正常，而Cu-NPS或硫酸铜处理的鱼肝则显示静脉内有血细胞沉积和窦扩张，窦变不规则(图1(B))，Cu-NPS组的肝损伤大于CUO 4组。

3、差异比较分析

分别与对照组比较后，在cu-nps和硫酸铜处理鉴定出差异表达的基因/蛋白。在cu-nps和cu-nps处理中，分别鉴定出1428和2239个表达差异显著的基因，其中911个基因在这两个处理中都很常见(图2(A))，总共有354和140个显著变化的蛋白质，其中75种蛋白质共同存在于这两种处理中(图2(B))。

4、基因和蛋白基于GO的功能分析

对差异表达的基因和蛋白质的功能进行了分类。共有11417个转录本和3210种蛋白质被分为三大类：生物学过程、细胞成分和分子功能(图3)。28788个GO被注释到11417个映射的转录本，10506个GO注释到3210个蛋白质中。参与“细胞过程”和“代谢过程”的基因和蛋白质是生物学过程中较大的两类，分别占转录本的20.4%和15.0%，以及14.8%和13.4%的蛋白质。在细胞成分类别中，基因和蛋白质涉及“细胞”(27.8%份转录本和20.7%份蛋白质)、“细胞部分”(27.8%份转录本和20.7%份蛋白质)和“细胞器”(19.2%份转录本)。在分子功能类别中，“结合”占49.6%个基因和46.2%个蛋白质，30.2%个转录本和36.1%个蛋白质具有“催化活性”(图3(C))。

5、COG功能分类

3294个蛋白及11619转录本被功能注释到(图4)。这些转录本和蛋白质分别分布在25和24个COG类别中，其中“仅一般功能预测”是转录本的较大组(总共1732个)和蛋白质(630)，之后是“信号转导机制”，“翻译后修饰、蛋白质翻转、伴侣”、“功能未知”、“转录”、“细胞内转运、分泌和囊泡转运”、“细胞骨架”和“RNA加工和修饰”。在“脂质转运和代谢”这类中转录本3.2%（总共372个）和蛋白质4.6%（153）

6、RNA与蛋白质表达的相关性分析

用蛋白质组学分析方法获得的差异表达蛋白与mRNA进行了比较分析；根据他们的氨基酸序列来匹配转录本，在Cu-NPs组与对照组及CuSO4和对照组相比较，分别共140（100%）和352（99.4%）个差异表达的蛋白。我们进一步确定在两种铜粒子下蛋白和基因的表达是否一致，发现21的转录和蛋白在同一方向改变（13个上调，八个下调）（表2）。有趣的是，大多数基因（16个基因）的表达在Cu-NPS比CuSO4更强烈，但是蛋白质却相反。

7、肝脏脂质含量和脂肪酸组成

与对照组相比，在两种铜形式下，肝脏中脂类、甘油三酯和胆固醇含量均显著降低，但两种铜形式下相比无显着性差异(P>0.05)。正常脂质积累(红色染色表明的脂滴)在对照组中明显增加，而Cu-NPS或硫酸铜暴露则减少了脂滴的数量(图5(D))，任何一种铜暴露均降低了总多不饱和脂肪酸，但总单不饱和脂肪酸和总饱和脂肪酸(Psfa)较对照组增加，而在Cu-NPS中，多不饱和脂肪酸(图5(E))的作用更为明显(图5(E))。与对照相比，cu-nps或硫酸铜暴露后，脂肪酸、二十碳五烯酸(epa，c20：5)、二十二碳六烯酸(dha，c22：6)和二十二碳五烯酸(dpa，c22：5)均下降，而cu-nps中脂肪酸组分的含量比cu-nps明显增加(图5(F))。

文章亮点

  • 石斑鱼是一种具有较大经济效益的鱼类本文研究其对两种铜形式下的毒害机理有着非常重要的实际应用价值。
  • 表型数据丰富，文章分别从不同铜形式下的粒子表型特征，到不同铜浓度下鱼死亡率，脂类物质的测定，铜浓度的选择进行研究及实验设计，有理有据，层次清晰。
  • 文章亮点在结合转录组及蛋白组数据联合分析紧密与毒害的表型数据相结合，从DEGs的COG和KEGG注释和富集分析的结果来解析毒害的分子机制。

 

 

 

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