在单细胞转录组测序实验中，需要从各种样本中制备单细胞悬液，针对不同的样本类型，如何获取活性高、完整性好、结团率低的单细胞悬浮液，是单细胞实验成功与否的关键所在。下面就分享从动物组织、血液、植物组织三种样本中获取单细胞悬浮液的基本制备方法和注意事项。
一、动物组织
动物组织由细胞外基质和嵌入细胞外基质的细胞组成，且细胞和细胞之间存在着大量的蛋白质，例如增强组织强度和韧性的胶原蛋白、弹性蛋白等；促使细胞和外基质结合的层黏连蛋白、纤黏连蛋白等。一般需要通过机械法或者酶解法得到单细胞悬浮液。
不同的组织类型需要不同的解离酶混合液，目前常用的有胶原酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等，将动物组织解离成单细胞悬浮液。根据具体组织类型选择对应的酶或酶的组合进行解离。
动物组织解离需要注意：
1、细胞离开母体后很脆弱，解离过程中酶混合液配比、酶浓度、离心速度、孵育温度、缓冲液等都可能影响细胞活性。
2、对于难解离的样本，需要优化解离酶混合液的配比和延长解离时间。
3、新鲜的组织才能用于单细胞悬浮液的制备，若是冰冻动物组织建议提取细胞核。
4、组织解离过程中，若细胞碎片过多，会大大降低细胞的捕获效率。
二、血液样本
外周血单核细胞(Peripheral blood monoculear cell, PBMC)中大部分都是淋巴细胞（包括B细胞和T细胞)，以及少部分的自然杀伤细胞和单核细胞，而红细胞和血小板没有细胞核，而粒细胞(granulocytes) 包括中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞，有多叶核，所以不包括在PBMC中。PBMC的制备采用密度梯度离心法，可通过Ficoll作为密度梯度介，使得不同密度的细胞在对应的界面处，然后通过快速离心，实现细胞分离。
图1. Ficoll分离细胞的原理效果图（图片来自于网络）
制备PBMC需要注意：
1、全血分离人PBMC，血液样本置于EDTA紫色抗凝管中保存，4℃保存不超过12h。
2、需缓慢将血液加在Ficoll上层，速度过快可能会冲破层界。
3、使用前需要将Ficoll溶液先恢复至室温，再进行后续实验。
4、搜集得到的样本若还含有大量的红细胞，需要进行二次裂红处理。
三、植物组织
近年来，关于人和动物的单细胞转录组测序应用越来越广泛，植物单细胞研究相对滞后且应用领域范围较小。因为与动物细胞相比，植物细胞多了一层细胞壁，阻碍了植物单细胞悬浮液的制备。一般需要通过酶解法将植物组织制备成原生质体，例如用纤维素酶以及果胶酶消化植物细胞壁的主要成分（纤维素、半纤维素、果胶等）。
原生质体制备需要注意：
1、幼嫩的组织，比如根尖、嫩叶等，细胞壁比较容易被酶消化。成熟或衰老组织需更长酶解时间，以便增加原生质体的获得率。
2、为了提高原生质体的制备率，建议PH的范围维持在5.6～6.0。
3、一般选用0.4M的甘露醇稳定剂来维持渗透压的平衡。
4.对于一些难制备原生质体的植物样本，可以考虑提取植物细胞核。
最后，制备合格的单细胞悬浮液/原生质体/细胞核样本，可以直接通过百创DG1000单细胞微液滴系统，实现高通量的单细胞精准捕获。百创DG1000是基于微流控、油滴包裹和Barcode标记等技术来实现高通量的细胞捕获。除了仪器以外，百创DG1000还有配套的2×4的独立芯片及配套试剂盒。
百创DG1000部分数据展示
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