RNA速率分析方法推荐

RNA 速率这个概念最初是在2018年提出的，可以通过测序结果与mRNA剪切动力学相关联，利用新转录的未剪接的前体 mRNA 和成熟的剪接 mRNA 可以在常见的scRNA-seq、stRNA-seq 流程中区分的事实，可以恢复定向动态信息，从而探索方向轨迹的演化。目前RNA速率分析可广泛应用于免疫微环境、发育模式、遗传进化等方向。那么今天我们一起来学习一下RNA速率分析流程及方法有哪些。

RNA速率分析1、获得重复序列注释文件

软件依赖：RMBlast、TRF ——> conda 安装即可

数据依赖：Repbase数据库

链接：https://pan.baidu.com/s/1F4E5-6XaVni1I_S97TEIDg 提取码：zq7t

下载后解压得到一个Libraries的文件夹

Repeatmasker下载：wget http://www.repeatmasker.org/RepeatMasker-open-4-0-6.tar.gz

下载后解压，将第二步 数据依赖 中Libraries文件夹下的内容拷贝到Repeatmasker目录下Libraries文件夹中

cp Libraries/* /path/to/Repeatmasker/Libraries/

安装可参考以下教程：

基因组重复序列检测：RepeatMasker的安装及使用可自行搜索安装

运行Repeatmasker：

/share/nas1/guochao/biosoftware/RepeatMasker/RepeatMasker -pa 60 -species “Mus musculus” -poly -html -gff -dir repeat /path/to/genome.fa

-species : 物种拉丁名

-dir : 输出结果目录，需提前创建好！

RNA速率分析2、构建loom文件

安装velocyto：pip install -i https://pypi.tuna.tsinghua.edu.cn/simple velocyto

具体安装方法可自行搜索

处理bam文件

perl脚本：

链接：https://pan.baidu.com/s/1F4E5-6XaVni1I_S97TEIDg    提取码：zq7t

perl am_add_flag.pl <BSTViewer_project/subdata/L1_heAuto/barcodes.tsv.gz> <sample/barcode.tsv> <BSTViewer_project/level_matrix/level_1/barcodes_cluster.tsv.gz>

：BSTMatrix输出结果 01.fastq2BcUmi目录下xxx.bc_umi_read.tsv.id

: BSTMatrix输出结果05.AllheStat目录下BSTViewer_project/subdata/L1_heAuto/barcodes.tsv.gz

<sample/barcode.tsv>: BSTMatrix输出结果样本名称目录下barcode.tsv文件

:BSTMatrix输出结果05.AllheStat目录BSTViewer_project/level_matrix/level_1/barcodes_cluster.tsv.gz

: BSTMatrix输出结果 03.Umi2Gene 目录下 xxxAligned.sortedByCoord.out.bam

: 输出路径

运行velocyto：

velocyto run -o ./ -m /path/mouse/mus_repeat.gtf new.bam ../mouse/genes.gtf

-o ： 输出路径

-m : 重复序列注释文件（第一步获得）

R转化loom文件为h5ad文件

library(Seurat)

library(SeuratWrappers)

library(SeuratDisk)

loom_data bm bm[[“RNA”]] bm bm bm bm bm

DefaultAssay(bm) <- “RNA”

SaveH5Seurat(bm, filename = “test.h5Seurat”)

Convert(“test.h5Seurat”, dest = “h5ad”)

scvelo RNA速率分析

adata = scv.read(‘/path/test.h5ad’)

scv.pp.filter_and_normalize(adata, min_shared_counts=20, n_top_genes=2000)

scv.pp.moments(adata, n_pcs=30, n_neighbors=30)

scv.tl.velocity(adata)

scv.tl.velocity_graph(adata)

scv.set_figure_params(dpi=300)

scv.pl.velocity_embedding_stream(adata, basis=”umap”, size= 10, alpha=0.6, color=”seurat_clusters”)