宏基因组在临床方面的应用：16s结合宏基因组测序揭示HRG治疗非酒精性脂肪肝的作用机制

2022年8月19日北京中医药大学与电子科技大学合作，在国际期刊JCR Q1区《Frontiers in Pharmacology》(IF:5.988)在线发表了题为“Revealing the Mechanism of Huazhi Rougan Granule in the Treatment of Nonalcoholic Fatty Liver Through Intestinal Flora Based on 16S rRNA, Metagenomic Sequencing and Network Pharmacology”研究成果。该研究通过宏基因组测序，16S rRNA基因测序、网络药理学和分子对接等手段，探讨了HRG（化滞柔肝颗粒）通过肠道菌群治疗非酒精性脂肪肝(NAFL)的作用机制。百迈客为该研究提供了16S rRNA基因测序和宏基因组测序和部分分析工作。

研究背景

非酒精性脂肪肝(NAFL)的发病率呈逐年上升趋势，越来越多的证据表明肠道菌群在NAFL中起着致病作用。化脂柔肝颗粒是临床上常用的治疗NAFL的药物。据报道，它可以降脂保肝，但还没有研究证实该药物的作用是否与肠道菌群有关。因此，研究者从肠道菌群的角度，研究其作用是否与肠道菌群调节有关，以进一步探讨其治疗NAFL的机制。

主要结果

1.高脂饲料引起的小鼠体内脂质蓄积

如图1所示，与BC组相比，模型组大鼠肝脏脂肪堆积增多，肝脏体积增大，颜色变白，边缘变钝。给药后，各组大鼠肝脏红化程度均有不同程度的改善，尤以TH组为佳。HE和油红O染色结果显示，模型组大鼠肝组织内可见较多的球状变性肝细胞和较多的红色脂肪，而给药组较少。MC组病理程度重，TH组轻，TL组与PC组之间无显著差异。因此，HRG可改善HFD诱导的肝脏脂肪堆积和体重增加，并且可能以剂量依赖的方式改善肝脏损伤。

2.血清分析

与空白组比较，模型组大鼠肝酶、血脂指标升高，其中TC、HDL-C、LDL-C、AKP、ALT、AST差异有统计学意义,而甘油三酯则无显著差异。给药后肝酶和血脂均低于模型组。丙氨酸氨基转移酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)在MC组和给药组之间有显著差异。各给药组间TC、ALT、HDLc差异无统计学意义。HRG组与PC组比较，AKP、AST、TG、LDL-C差异有统计学意义。

TM组和TH组降低AKP效果优于TL组，TG组降低AKP效果优于TM组。PC组降低AKP的效果优于TL组，但差于TM组和TH组。PC组降低低密度脂蛋白胆固醇的效果优于TM组和TH组，表明高脂饲料可导致大鼠血脂和肝酶代谢异常，高脂高脂颗粒可改善高脂大鼠血脂代谢和肝酶活性。与阳性药物相比，HRG在改善高密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯、碱性磷酸酶方面具有优势，且改善程度可能呈剂量依赖性。各组间器官指数无显著差异，HRG对小鼠生化指标和器官指数的影响如图2所示。

3.微生物多样性分析

对粪便样本进行16s rRNA基因测序分析，在门、纲、目、科和属的水平上对微生物群进行了鉴定和分析，最终共鉴定到17门、26纲、56目、86科、187属。主要物种为厚壁菌门和拟杆菌门，其次是放线菌门、疣微菌门和变形菌门。此外，物种主要分布在uncultured_bacterium_f_Muribaculacea属和lachnospiraceae NK4A136 group，其次是uncultured_bacterium_f_Lachnospirae、Lactobacillus和Akkermansia。

在门水平（图 3A、B），MC 组的厚壁菌门、变形菌门和放线菌门的水平高于 BC 组，而拟杆菌门和疣微菌门的水平较低。与BC组相比，给药组厚壁菌门和变形菌门水平降低，尤其是TH组；放线菌在 TH 和 TM 组中减少，在 TM 组中最显著，但在 PC 和 TL 组中增加。拟杆菌在 TH 和 TM 组中显着高于 MC 组，Verrucomicrobia 在 TH 和 TM 组中增加最显著。与BC组相比，MC组在属水平上乳酸杆菌和脱硫弧菌的比例更高。相比之下，Akkermansia 和 Ruminococcaceae UGG-014 所占比例较低。给药后乳杆菌（TH组下降多）和脱硫弧菌（TH组下降多）减少，Akkermansia（TH组增加多）和瘤胃球菌UGG-014（PC组增加多）增加。给药后乳杆菌和脱硫弧菌减少，阿克曼氏菌增多，尤其是TH组； Ruminococcaceae UGG-014 增加，特别是在 PC 组。因此，初步推测HRG可增加拟杆菌门、疣微菌门、未培养菌f Lachnospiceae和Akkermansia，减少厚壁菌门和变形菌门、乳酸杆菌和脱硫弧菌。HRG可通过改变NAFL小鼠肠道菌群结构改善NAFL。

肠道菌群聚类显示BC组和MC组样本微生物群落差异明显，给药组、BC组和MC组微生物群落差异显著。此外，Bray-Curtis PCoA 证实了这些发现（图 3J）Curtis PCoA 证实了这些发现（图 3J）。 PC1（15.21%）能较好地区分BC和MC组、MC和TM、TH组微生物群落。这些数据进一步表明BC和MC组在微生物群落结构上存在较大差异，并且HRG施用组和对照组在微生物群落结构上存在较大差异。

进一步通过LEfSe分析寻找表明组间差异biomarker。结果表明，在门水平上差异物种为拟杆菌门、放线菌门、厚壁菌门和疣微菌门在是显着差异物种。在属水平上，差异物种为双歧杆菌、拟杆菌、Alloprevotella、Lactobacillus、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Dubosiella、Faecalibaculum和Akkermansiaceae。AFL小鼠和HRG组的优势菌群主要为厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和拟杆菌门。在属水平上，差异物种主要为Adlercreutzia和Ruminococcaceae_UCG-013、Sphingomonas等。表明HRG可能通过改变厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和拟杆菌门的菌群来改善NAFL。

对肠道菌群丰度和血清指标参数进行 RDA 分析，结果表明，AKP、HDL-C、TC、TG与物种分布高度相关，且呈同向分布。在属水平上，它们与Faecalibaculum、Desulfovibrio、Dubosiella和Lactobacillus呈正相关，与Bacteroides、Akkermansia和Alloprevotella呈负相关。在门水平上，AKP、HDL-C和TG与物种分布高度相关，与厚壁菌门和放线菌门呈正相关，与Epsilonbacteraeota和Verrucomicrobia呈负相关。 Acidobacteria 和 Proteobacteria 与 AKP 和 HDLC 呈负相关，与 TG 呈正相关。拟杆菌与HDL-C呈正相关，与AKP、TG呈负相关。结果表明，这些菌落丰度的变化与NAFL小鼠给药前后肠道菌群的结构变化密切相关。

3.网络药理学

通过对药材中重复成分的筛选和去除，得到249个有效成分。将上述化合物用于靶标预测、校正和重复靶标的删除，共获得1186个靶标的标准基因名称。HRG的“草药-化合物靶点”网络如图4A所示(黄色节点代表药物靶点，绿色节点代表化合物，红色节点代表草药)，在20个节点中，高度值的14个化合物被选为关键化合物(表3)。NAFL的PPI网络如图4B所示，IFD的PPI网络如图4C所示。
将与NAFL相关的靶点、与IFD相关的靶点、与化合物对应的靶点同时合并，得到了HRG通过肠道菌群治疗NAFL的靶点(图4D)。对合并后的网络进行模块分析和细胞Hubba分析。模块分析显示模块1(图4E，Score=7.2)和模块2(图4F，Score=7.0)，而cell Hubba分析显示前10个目标(图4G)。最终获得了10个潜在的治疗靶点：CXCL10、CXCL8、ICAM1、IFNG、IL10、IL1B、IL2、IL4、IL6、TNF。图4A-F中的节点大小与度值呈正相关。图4B-F中的节点颜色与度值呈正相关。

(A)HRG药材靶点网络。(B)与NAFL有关的PPI网络。(C)与IFD有关的PPI网络。(D)HRG-IFD-NAFL合并目标的PPI网络。(E)模块1(F)模块2(G)Hub基因。(H)草药-关键化合物-潜在靶向途径网络。(I)关键靶点可能导致的关键生物进展图例。

利用10个关键治疗靶点、14个关键化合物和相关通路，通过Cytoscape构建了“药草-关键化合物-潜在靶点-通路”的网络图（图4H）。排名前三的化合物被选为潜在化合物（槲皮素、木犀草素、山柰酚）。选择前三个信号通路作为关键通路。绘制了 HRG 通过肠道菌群治疗 NAFL 的通路机制（图 4I）。将10个关键靶点与3个潜在化合物进行分子对接，共获得18对对接结果（表4），使用 Pymol 可视化结果（图 5）。

4.宏基因组测序

通过宏基因组测序研究基因功能，基于KEGG(图6A、B)、GO(图6C)、EGNOG(图6D)、CARD(图6E)和CAZY(图6F)数据库进行了功能注释，共注释到了6055个KO(KEGG Ontology)和2104个EC(Ease)。结果表明，相应的复制、推荐、修复和一般功能预测功能基因只占较高的比例。细胞壁/膜/被膜的生物发生和碳水化合物的运输和代谢位居第二。CARD数据库的标注结果表明，四环素类和多药耐药对应的耐药基因相对含量较高，其次为氟喹诺酮类和氨基糖苷类。CAZy数据库的注释结果表明，糖苷水解酶(GH)、糖基转移酶(GT)和非催化糖结合模块(CBM)是前三位的碳水化合物酶。

图6G-L显示了在每个组和样本的不同水平上的KEGG通路的组成。与空白组和模型组相比，模型组3个层级通路的丰度均有不同程度的增加。推测HRG可能通过增加与代谢调节相关的代谢途径来改善NAFL。

进一步用MetagenomeSeq分析检测第 3层级 KEGG的丰度差异(p<0.05)，丰度差异图如图6M-X所示。结果表明，MC组蛋白酶体丰度显著高于BC组，MC组倍半萜和三萜生物合成显著低于BC组。与MC组相比，PC组改变了这一趋势。与BC组相比，HRG组降解苯甲酸氟化物和降解甲苯的丰度更高。与MC组相比，HRG组丰度较高的代谢途径包括氨基苯甲酸降解、类胡萝卜素生物合成等。因此，HRG可能通过代谢和细胞过程改善NAFL，代谢相关途径在其中起重要作用。氨基苯甲酸的降解、类固醇的生物合成、倍半萜和三萜的生物合成是重要的代谢途径。

总结

综上所述，HRG可能通过改变微生物多样性、结构和功能来改善高脂饮食诱导的NAFL。还有可能通过调节肠道相关的代谢途径、炎症反应和免疫反应来改善NAFL相关的脂肪堆积和肝脏损伤。这些结果有力地表明，HRG可能通过预防肠道菌群失调来减轻NAFL。此外，HRG可通过肠道菌群治疗多种成分、多代谢途径、多靶点的NAFL。本研究为NAFL的治疗提供了新的思路，证实了肠道菌群与NAFL之间的关系，提示HRG具有良好的治疗效果。

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