转录组+代谢组联合解析柑橘类果实的油斑病损伤过程中木质素的积累机制

研究背景

油斑病是发生在许多柑橘果实收获前的成熟和收获后的贮藏期间的一种生理性疾病，尤其是在生理成熟不足时采摘的酸橙、柠檬和橙子，影响柑橘果实外观品质，常伴有柑橘类皮的木质化。油斑病典型症状为油腺破裂、相邻表皮凹陷伴组织坏死、油腺突出，以及形成不规则形状的黄棕色斑点。油斑病可由几种类型的损伤引起，例如采前非生物胁迫（风、冰雹）造成的损伤和采后处理不当造成的机械损伤，尤其是当果皮在高膨压下受损时。研究发现木质素参与抵御生物和非生物胁迫的防御机制，有报道称，受损或感染的柑橘果皮中木质素积累增强，然而，在柑橘类果实黄化过程中木质素积累的分子机制仍不清楚。

柠檬世界上一种重要的园艺作物，具有丰富的营养和健康物质。青柠檬中油斑病的发病率很高，采后油斑病的发生是青柠檬生产和发展的主要瓶颈。因此，作者通过代谢组学分析来研究初级和次级代谢产物的变化，并结合转录组学和组织化学分析来探索青柠檬果实的油斑病损伤中木质素的积累。然后，通过接种青霉来研究油斑病对病原体耐药性的影响，从形态学、代谢和分子水平上分析了油斑病损伤后木质素积累的机制。

材料方法

实验材料:云宁1号青柠檬，采自中国云南省红河州。

实验方法：初级代谢物分析采用GC-MS的方法测定初级代谢物；次级代谢物分析：LC-QTOF-MS法；木质素总含量测定：280nm吸光度法；木质素形态和分布的组织化学分析：显微镜成像；RNA测序：Illumina HiSeq2500。

主要研究结果与分析

1、油斑病对初级代谢物组成的影响

主成分分析显示健康和油斑病损伤的柠檬皮的初级代谢物含量存在明显差异，轻度油斑病的主要代谢产物与重度油斑病的主要代谢产物也明显分离，但与中度油斑病的主要代谢产物无明显差异(Fig. 2A)。在健康和油斑病损伤的柠檬皮中共检测到41种初级代谢物，包括有机酸、糖、氨基酸和醇等。与健康柠檬皮相比，轻度、中度和重度油斑病的初级代谢物总含量分别降低了21.8%、25.8%和20.8%，主要的初级代谢产物为油斑病中的糖和有机酸；有机酸总含量分别下降了29.6%、30.9%和32.1%，糖类总含量分别下降了16.9%、21.1%和13.7%。轻度、中、重度油斑病柠檬皮的有机酸和糖总含量无显著差异。

所有样品中共检测到13种有机酸(Fig. 2B)，其中奎宁酸含量最多，其次是苹果酸。除草酸和棕榈酸外，油斑病损伤柠檬皮中大多数有机酸水平较低，但轻、中、重度油斑病柠檬皮间无显著差异。所有样品中均检测到10个氨基酸(Fig. 2B)，除与胁迫相关的氨基酸如脯氨酸、伽氨基丁酸和谷氨酸外，其余氨基酸均显著增加(Fig. 3B)。轻度、中度和重度油斑病柠檬皮中脯氨酸含量分别为健康柠檬皮的1.34、1.36和1.64倍。

此外，在健康和油斑病损伤的柠檬皮中检测到18种糖和醇(Fig. 2B)。除果糖、蔗糖、半乳糖、甘油和松果醇外，大部分糖含量显著下降，随着油斑病严重程度的增加而逐渐增加。与健康柠檬皮相比，轻度、中度和重度油斑病柠檬皮的葡萄糖含量分别下降了43.1%、51.9%和51.8%。以上结果表明，柑橘类油斑病的发生降低了初级代谢物的总含量，和大多数主要代谢物例如葡萄糖、奎宁酸和苹果酸等含量显著下降，但蔗糖、脯氨酸、GABA和谷氨酸等在油斑病损伤的柠檬皮中含量升高外。

2、油斑病对次生代谢产物组成的影响

被油斑病损伤的柠檬皮的颜色变成棕色，伴随着酚类和木质素含量的变化。为了评价油斑病对次生代谢物的影响，采用LC-QTOF-MS法测定其次生代谢产物的种类和含量。在健康和油斑病受损的柠檬皮中共检测到51种代谢物，包括3种初级代谢物和48种次级代谢物。PCA分析显示健康和油斑病之间存在明显的分离(Fig. 3A)。以上结果表明，油斑病引起柠檬皮的次生代谢物的变化较大，但油斑病程度对次生代谢物的分布没有显著影响。

次生代谢产物组成分析表明，油斑病增加了次生代谢产物的含量。与健康柠檬皮化合物相比，油斑病柠檬皮的化合物的次生代谢物前体(包括酪氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸)明显减少(Fig.3B)，同时，大量次生代谢物的积累也更加显著，包括水杨酸、3-甲氧基肉桂酸、丁香酸、芥子酸、对香豆酸、香兰素、绿原酸、松柏素等，尤其是木质素单体成分。重度油斑病柠檬皮化合物中丁香酸、丁香苷和针叶素含量分别为健康柠檬皮化合物的1.25倍、1.29倍和5.57倍，而轻度、中度和重度油斑病柠檬皮化合物中丁香酸、丁香苷和针叶素含量差异不显著。此外，几种次生代谢产物在油斑病损伤的柠檬皮中略有增加，但与健康柠檬皮无显著差异

3、油斑菌病对柠檬皮中木质素积累的影响

为了从形态学角度揭示油斑病对柠檬皮中木质素积累的影响，采用间苯三酚-盐酸反应对健康和油斑病柠檬皮的横截面进行了木质素化研究。在染色前，健康柠檬皮的细胞排列整齐，没有塌陷，而轻度油斑病柠檬皮的细胞似乎塌陷并堆积在一起。随着油斑病严重程度的增加，细胞的堆积越来越明显，细胞间组织的塌陷导致不同程度的破裂，特别是在油斑病严重的柠檬皮中，可以观察到许多裂痕洞（Fig. 4）。

为进一步证实油斑病对柠檬皮中木质素积累的影响，测定了不同油斑病程度柠檬皮中木质素含量。结果表明，油斑菌病显著提高了木质素含量，且呈程度依赖性。中度油斑病柠檬皮与轻度和重度油斑病的柠檬皮的木质素含量无显著差异。与对照组相比，轻度、中度和重度油斑病的柠檬皮中总木质素含量分别显著增加了51.2%、69.7%和79.6%(Fig. 5)，这与染色结果一致。

4、健康和油斑菌病损伤柠檬皮的基因表达模式

为了从分子水平研究油斑病损伤柠檬皮代谢产物的基因调控机制，对健康和严重油斑病柠檬皮进行了转录组测序。在健康柠檬皮和油斑病损伤柠檬皮中共鉴定到2198个上调和1415个下调的DEGs。1810个DEGs被注释到已知的代谢途径，其中GO生物过程中与生长负调控、甲壳素分解代谢过程、氧化还原过程、肉桂酸生物合成过程、木质素生物合成过程和碳水化合物代谢过程显著富集。KEGG通路包括苯丙氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、糖代谢和糖酵解/糖异生、植物激素信号转导和光合生物的碳固定丰显著富集(Fig. 6)。

5、与糖代谢相关的差异表达基因

糖酵解和磷酸戊糖途径是葡萄糖分解代谢的两个重要途径，糖酵解是果实生命活动的核心代谢途径。PCKA基因显著上调，促进了油斑病损伤柠檬皮中磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的生成。PEP中磷酸在丙酮酸激酶(PK)的催化下发生转移，然后在丙酮酸脱羧酶(PDC)、丙酮酸脱氢酶E2组分(PDHC)、醛脱氢酶(NAD+) (ALDH)的作用下生成丙酮酸和乳酸。糖酵解途径中大部分的DEG被上调，糖酵解在油斑病的柠檬皮中增加。此外，磷酸戊糖途径是葡萄糖分解代谢的另一个分支。葡萄糖通过磷酸戊糖途径分解生成磷酸赤藓，葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(G6PDH)和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)是该途径的关键限速酶。柠檬皮中6PGDH基因表达显著上调，促进了葡萄糖的分解和赤藓4-磷酸的产生。这些结果可以解释代谢组分析结果中葡萄糖含量显著下降的原因。

糖酵解产生的PEP和4-磷酸赤藓是合成苯丙氨酸和酪氨酸的前体物质，除酪氨酸转氨酶编码基因TAT外，其他基因均显著上调。在这一途径中，3-脱氧-7磷酸七酸合酶(DAHP)和3-脱氢喹酸脱氢酶/莽草酸脱氢酶(DHQ-SDH)是关键的限速酶，在油斑病损伤柠檬皮中显著上调，表明莽草酸途径被激活，促进了苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的积累。然而，代谢数据显示，苯丙氨酸和酪氨酸在油斑病损伤柠檬皮中显著减少。这是因为苯丙氨酸和酪氨酸是苯丙素代谢途径中的前体，并可能继续合成其他物质。

6、与木质素积累相关的差异表达基因

苯丙烷代谢是连接一级代谢和二级代谢、合成类黄酮和木质素的最关键的代谢途径，而苯丙素生物合成是KEGG通路中最富集的途径。共鉴定出35个编码苯丙氨酸代谢关键催化酶的基因，均为木质素生物合成相关的上调基因。在木质素特异性合成途径中，阿魏酸-5-羟化酶(F5H)基因表达上调。在木质素合成途径下游，肉桂酰辅酶a还原酶(CCR)和过氧化物酶(POD)表达上调。此外，在木质素单体合成的转导途径中，UDP -糖基转移酶72E (UGT72E)的表达量在油斑病损伤柠檬皮中显著升高，这些基因均与木质素积累呈显著正相关(Fig. 7)。综上所述，油斑病的发生主要通过增加苯基丙烷代谢途径和木质素合成特异途径的基因表达来影响柠檬皮中木质素的积累。

7、油斑病对青霉菌症状的影响

柠檬皮在油斑病中积累了大量的抗性物质。为了进一步说明油斑病对果实抗性的影响，对健康和油斑病受损的柠檬皮为例进行了接种。结果表明，接种5 d后，健康柠檬皮接种部位周围有小病变区，青霉孢子较多，有水渍圈，油斑病受损柠檬皮接种部位也有小病变区，但没有水渍圈(Fig. 8)。8 d后，健康柠檬皮的病变面积和水渍圈明显扩大，而油斑病受损的柠檬皮病变面积和水渍圈没有明显变化。接种后9 ~ 10 d，病变面积和水渍圈不断增大;结果，果实软化腐烂。但油斑病仍表现出较高的硬度，病变面积没有扩大，青霉孢子的粘附和生长受到明显抑制。

总结

本研究采用多种生物学方法对青柠檬油斑病木质素积累的机制进行了分析。油斑病损伤柠檬皮的初级代谢物（尤其是葡萄糖）显著降低，次级代谢物（尤其是木质素）显著增加。柠檬皮在油斑病下发生严重的木质化，苯丙素的生物合成被显著激活，与木质素积累相关的DEGs有79个，其中65个基因显著上调，尤其是PAL、C4H、CCR、F5H POD和UGT72E基因。油斑病损害的柠檬皮具有较高水平的木质素积累和增强对病原真菌的防御。该研究是首次报道柠檬油斑病对病原真菌表现出较高的抗性。

 

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