转录组学和代谢联合分析揭示了枣树叶芽和成熟叶之间不同的代谢产物生物合成谱

背景介绍

枣叶以其高营养价值和药用价值而闻名。然而，目前对枣叶中存在的代谢物缺乏全面和动态的评估。根据枣果和枣叶的着色模式可将其分为两类，I型包括大多数品种，其特点是果实颜色从绿色变为黄色，然后变为红色，叶片颜色从浅绿色变为深绿色。II型包括一些观赏品种，枣树果实从紫色变为黄色，然后变为红色，叶子颜色从紫色变为深绿色。研究表明叶绿素含量在果实发育早期达到峰值，并随着果实成熟而降低。花青素决定成熟期枣果的颜色，至今为止已从枣皮中鉴定出15种花青素，其中三种花青素随着果实成熟过程而增加，有两种转录因子共同调节花青素的积累。目前，大多数研究都集中在果实颜色的色素成分和遗传基础上，而有关叶片颜色的信息却少得多。该研究总结了两个紫叶枣品种的叶芽和成熟叶的代谢和转录组学特征。此外，还测定了相关基因的表达，并评估了光照对类黄酮积累的影响。作者阐明了枣叶颜色变化的代谢产物动态变化和分子调控机制。

实验材料与方法

实验材料：本研究使用了两个紫叶枣品种和八个绿叶枣品种。转录组和代谢组材料：两个紫叶枣品种，“Sanbianhong”和“Tailihong”， 叶芽分别命名为LS1和LT1，成熟叶分别命名为LS2和LT2（图1）

实验方法：对于光处理的植物，叶芽在萌发后暴露在自然光下。对于暗处理的植物，叶芽被黑色袋子覆盖，并在5d后移除。转录组测序平台：Illumina HiSeq X Ten；代谢组用UPLC-MS/MS。

结果与分析

1、基于UPLC-MS/MS的枣叶定量代谢组学分析

根据聚类和相关性分析，12个样本被明确分为四组（图2A）。PCA主成分在LS1、LS2、LT1和LT2之间也表现出明显的分离（图2B）。图2C所示，共鉴定出778种代谢物，可分为18类，但大多数代谢物可分为六类，包括类黄酮（23.14%）、有机酸和衍生物（14.52%）、氨基酸和衍生物（11.70%）、脂类（8.35%）、苯丙烷类（8.23%），核苷酸及其衍生物（6.68%）。黄酮类化合物显然是主要的代谢产物，其可进一步分为79种黄酮类化合物、40种黄酮醇、17种黄酮类化合物、12种花青素、7种异黄酮、3种原花青素和22种其他黄酮类化合物。在这些代谢物中，分别从LS1、LS2、LT1和LT2中检测到732、690、729和708种代谢物（图2D）。总的来说，结果表明了叶芽和成熟叶具有不同的代谢产物谱。

2、叶芽与成熟叶片的代谢组学变化

在LS1和LS2之间中共检测到313 DAMs，LS1中有205个代谢物上调和108个代谢物下调（图3A）。在LT1和LT2之间确定的316个DAMs中，211和105个代谢产物在LT1中分别上调和下调（图3B）。LS2 vs. LS1 中的DAMs可分为14类以上，大多数DAMs可分为五类，包括类黄酮（25.56%）、有机酸和衍生物（13.74%）、氨基酸和衍生物（12.46%）、苯丙烷类（7.99%）以及核苷酸和衍生物（7.03%）。这些黄酮类化合物可进一步分类为37种黄酮类化合物、19种黄酮醇、9种黄酮类化合物、3种异黄酮类化合物、2种花青素、1种原花青素和9种其他黄酮类化合物。同样， LT2 vs. LT1组中的DAMs也可以分为类似的类别，类黄酮（26.27%）、有机酸及其衍生物（12.03%）、氨基酸及其衍生物（11.08%）、苯丙烷类（9.81%）、脂类（9.49%）、核苷酸及其衍生物（8.54%）占很大比例。83种黄酮类化合物包括40种黄酮类化合物、18种黄酮醇、9种黄酮类化合物、7种花青素、1种原花青素、1种异黄酮和7种其他黄酮类化合物。多重比较分析表明，在“Sanbianhong”和“Tailihong”中都检测到超过一半的DAMs（194种代谢物）（图3C）。

DAMs也可大致分为两组，第一组DAMs由抗氧化成分组成，包括类黄酮、生物碱、萜烯、维生素和衍生物、酚酰胺、多酚和甾体。大多数抗氧化成分在叶芽中的浓度高于成熟叶片中的浓度。第二组是味觉成分，包括有机酸和衍生物、氨基酸和衍生物以及碳水化合物。叶芽中的主要氨基酸和衍生物以及碳水化合物含量显著高于成熟叶片。相反，有机酸及其衍生物的含量在“Sanbianhong”和“Tailihong”之间没有表现出一致的变化趋势。综上所述，我们的结果表明，“Sanbianhong”和“Tailihong”表现出相似的代谢物积累模式。在枣叶发育过程中，约40%的代谢产物表现出显著差异，黄酮类化合物是主要的差异代谢产物。

3、叶片颜色变化背后的色素积累

为了阐明叶片颜色变化的色素生物合成机制，测定了两个紫叶品种（“Sanbianhong”和“Tailihong”）和一个绿叶品种的色素含量。紫叶和绿叶品种的叶绿素和类胡萝卜素含量表现出相似的积累模式，随着叶片发育而急剧增加（图4A和B）。“Sanbianhong”和“Tailihong”的花色苷含量在成熟过程中显著降低。相反，“Fengmiguan”的花青素含量显著增加（图4C）。因此，结果表明，叶片颜色变化主要由花青素决定。

为了进一步检测花青素的类型，将花青素与代谢物数据库进行比较。其中两种花青素，即花青素O-丁香酸和芹菜苷氯化物，在叶芽中表现出较高的含量，其他花青素在叶片发育期间保持在稳定水平（图4D）。从“Tailihong”的叶片中鉴定出11种花青素。其中三种花青素，即芹菜苷氯化物、花青素和花青素O-丁香酸随着成熟过程而减少。相反，四种花青素，即飞燕草素3-O-葡萄糖苷、天竺葵素、牡丹素和矮牵牛素3-O-葡萄糖苷，随着叶片发育而增加（图4D）。多重比较表明，氰基邻丁香酸和芹菜素氯化物在两个紫叶品种的叶芽着色中起着关键作用（图4E）

4、类黄酮结构和调控基因的差异表达

为了研究叶芽和成熟叶片之间的基因表达谱，从LS1、LS2、LT1和LT2制备了四个cDNA文库。在LS1和LS2之间共检测到9534个DEG，LS1中有5181个基因上调和4353个基因下调。与LT2相比，LT1中有3645个基因上调，2516个基因下调。

根据代谢组学分析结果，黄酮类化合物是枣叶中的主要代谢产物，并决定了枣叶的颜色。在“Sanbianhong”中，在LS1和LS2之间检测到20个差异表达的类黄酮结构基因，并且所有基因都随着叶片发育而减少（图5）。同样，在成熟过程中，“Tailihong”中19个类黄酮结构基因的表达大幅下降（图5）。此外，“Sanbianhong”中差异表达的类黄酮结构基因大部分与“Tailihong”中的DEGs重叠，包括一个C4H基因、两个CHS基因、一个CHI基因、一个F3H基因、一个F3′H基因、一个F3′5′H基因、一个FLS基因、两个DFR基因、两个LAR基因、四个ANS基因和一个UFGT基因。

R2R3-MYB转录因子、bHLH转录因子和WD40重复蛋白在调节类黄酮生物合成中发挥重要作用。在LS1和LS2之间共检测到170个差异表达的类黄酮调节基因。LS1中有95个基因上调，包括52个R2R3-MYB基因、25个bHLH基因和18个WD40基因。

LS1中有75个基因下调，包括49个R2R3-MYB基因、12个bHLH基因和14个WD40基因。在LT1和LT2之间检测到37个差异表达的类黄酮调节基因。27个基因上调，包括6个R2R3-MYB基因、21个bHLH基因和4个WD40基因；然而，只有两个R2R3-MYB基因、3个bHLH基因和1个WD40基因在LT1中下调。27个上调基因和5个下调基因在两个品种之间重叠，包括7个R2R3-MYB基因、21个bHLH基因和4个WD40基因。

5、光照对叶芽黄酮积累的影响

光照是影响类黄酮积累的重要因素。为了研究光照对红枣叶片中黄酮类化合物积累的影响，在光照和暗照条件下分别培育了‘Sanbianhong’和‘Tailihong’的叶芽。黑暗条件下的叶芽呈绿色（图6A）。与光照处理的叶芽相比，黑暗处理的叶芽中总黄酮和总花青素的含量显著降低（图6B和C）。我们通过qRT-PCR分析进一步研究了主要类黄酮结构基因的表达水平，发现与光照处理的叶芽相比，黑暗处理的叶芽中的大多数基因显著下调（图6D-M）。综上所述，这些结果表明枣叶中的黄酮类化合物以光依赖的方式积累。

图6暗处理条件（LS1-D和LT1-D）和光处理条件（LS1-L和LT1-L）下叶芽中类黄酮的积累。

结论

本研究从枣叶中鉴定出778种初级和次级代谢产物。大约40%的代谢产物在叶芽和成熟叶之间存在显著差异。这些可以DAMs大致分为两组，包括抗氧化成分和味觉成分。黄酮类化合物是主要的DAMs，花青素决定了叶片的颜色，并以光依赖的方式积累。此外，通过RNA-Seq和qRT-PCR进一步分析黄酮类化合物的生物合成。总之，我们的研究结果提高了人们对枣叶化学成分和药用价值的认识，为枣叶作为功能性食品的开发提供了理论支持。

 

如果您对该测序方案感兴趣，欢迎点击下方按钮联系我们。