分类： 转录组测序
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杂志：BMC Genomics

影响因子：3.594

研究背景

龙眼(Dimcarpus Longan Lour.)为无患子科热带/亚热带常绿果树，原产于中国南部和东南亚，现已在东南亚、南亚、澳大利亚和夏威夷等地广泛种植。龙眼胚发育状况与种子大小、座果率、果实产量和品质密切相关。由于其高度的遗传杂合性和在体内获取早期胚胎的困难，在分子水平上阐明胚胎发育机制仍然是一个巨大的挑战。植物体细胞胚胎发生（SE）几乎在所有发育阶段都与正常合子胚胎发生有密切的相似性，SE已被广泛用于研究植物早期胚胎发生的分子调控机制研究中。在过去的几年里，利用RNA-seq测序技术挖掘了棉花、拟南芥、玉米、挪威云杉、椰子、巴西松、樟树、草莓、水稻、小百合、山竹、番木瓜和小麦等不同物种SE相关基因及调控模式，最近，龙眼基因组草图序列问世，为研究SE的分子调控提供了全面的基因组信息。从非胚性愈伤组织(NEC)到胚性愈伤组织(EC)，从EC到体细胞胚的转变是SE的关键步骤。然而，龙眼SE过程中的分子调控机制在很大程度上还不清楚。

材料方法

转录组测序材料：龙眼NEC、EC、不完全致密原胚性组织(ICpEC)和球形胚(GE)组织，每组3个生物学重复；

测序平台：Illumina HiSeq™ 2000

QRT-PCR验证：龙眼NEC、EC、ICpEC、GE、鱼雷状胚(TE)和子叶胚(CE)

研究结果

  1. RNA-Seq 与基因组比对分析

为了在转录水平上全面了解龙眼SE，作者对四个体外胚胎发育阶段(NEC、EC、ICpEC和GE)进行了测序。去除低质量序列后，共获得了243,783,126 clean reads，在与龙眼参考基因组比对后，4个cDNA文库分别有48,798,229(81.62%)，52,623,741(81.1%)，48,346,067(81.14%)和48,871,200(82.08%)测序数据比对到龙眼参考基因组。其中44,655,772个(74.69%)，48,333,703个(74.50%)，44,490,292个(74.67%)，44,924,511个(74.45%)唯一比对。同时，4个cDNA文库中分别有34,380,246(57.51%)，35,386,494(54.54%)，30,535,088(51.25%)和29,214,788(49.07%)个比对到基因。4个文库分别产生了22743、19745、21144和21102个转录本，过滤掉小于180bp的短序列和低于2的低测序深度序列后，在4个样本中分别检测到1935、1710、1816和1732个新基因。其中1025、819、832和806个为编码RNA。4个阶段共检查到130,354个AS事件，包括外显子跳跃、内含子保留、5’可变剪接和3’可变剪接。检出AS事件多的是GE(39,768)，其次是ICpEC(36,446)和NEC(35,084)，EC少(19,056)。外显子跳跃是所有样本中少的剪切类型，内含子保留是NEC、ICpEC和GE中常见的AS事件类型。

图1 可变剪切类型分析

  1. 基因表达分析

NEC、EC、ICpEC和GE期分别有22743，19745，21144和21102个基因表达。其中，75.3%以上的基因在4个发育阶段均有表达，2645个基因仅在NEC中表达。然而，在EC、ICpEC和GE阶段中特有表达基因只有366、505和588个，这表明在这四个发育过程中存在着不同的空间转录模式。通过RSEM软件将基因表达归一化为FPKM，以FPKM>60筛选高表达基因，NEC、EC、ICpEC和GE中高表达基因分别为2961个(11.40%)、3445个(13.26%)、3445个(13.26%)和3442个(13.25%)。与SE相关的基因LEC1、L1L、PDF1、LTP、HSP90等在EC、ICpEC和GE中高表达。

为了揭示与早期SE相关的基因表达信息，作者以|log2Fold Change|≥1和FDR<0.001为阈值，筛选差异表达基因(DEG)，四组比较如下：NEC_VS_EC、EC_VS_ICpEC、EC_VS_GE和ICpEC_VS_GE，分别筛选出10642，4180，5846和1785个差异表达基因。与NEC相比，EC有4887个基因表达上调，5755个基因表达下调。与EC相比，ICpEC有2689个上调基因和1491个下调基因，GE有3451个上调基因和2395个下调基因。与ICpEC相比，GE有832个基因表达上调，953个基因表达下调。DEGs分析表明，龙眼转录组在SE过程中发生了显著的动态变化，特别是在NEC向EC的过渡期。因此，本文提供的龙眼SE转录组数据可能为今后的研究提供了有价值的分子资源。

图2 差异表达基因分析

  1. 差异基因的GO与KEGG分析

为了评估DEGs的潜在功能，作者使用GO数据库对差异基因进行注释，在所有分组中，在biological process中所占比例大的是“代谢过程”，“细胞过程”、“单个生物过程”、“对刺激的反应”和“定位”，在cellular component中所占比例是“细胞”和“细胞部分”，“细胞器”和“膜”，在“molecular function”中所占比例大的是“催化活性”、“转运蛋白活性”、“分子转导活性”和“核酸”。作者利用KEGG数据库对DEGs的功能进行了分类，重点是生物学途径。根据KEGG注释，将6516个DEGs (NEC_VS_EC)注释到128个通路，将2514个DEGs (EC_VS_ICpEC)注释到126个通路，将3555个DEGs (EC_VS_GE)注释到126个通路，将1062个DEGs (ICpEC_VS_GE)注释到111个通路。这些通路主要集中在“代谢途径”、“次生代谢物的生物合成”、“植物-病原菌相互作用”和“植物激素信号转导途径”。此外，还有数十个基因参与了“类黄酮生物合成”、“苯丙烷生物合成”、“玉米素生物合成”、“脂肪酸生物合成”和“不饱和脂肪酸生物合成”。

  1. 植物激素信号通路及类黄酮和脂肪酸生物合成相关基因分析

根据KEGG注释信息，植物激素相关基因显著差异，EC与NEC和早期SE相比，生长素和细胞分裂素生物合成和信号转导途径的基因显著差异表达。在生长素生物合成中，除PAI外，色氨酸合成关键基因ASA、IGS、TSA、TSB在EC中表达上调，并在SE早期保持高表达。此外，参与脱落酸、赤霉素、乙烯、水杨酸、茉莉酸和油菜素甾体信号转导途径的众多基因在龙眼SE中也有差异表达。这样的观察表明，激素及其复杂的通路在SE早期起着重要作用。因此，植物激素信号通路可能是龙眼早期SE的关键调控因子。

类黄酮生物合成和脂肪酸生物合成是KEGG的代表途径，在早期的SE过程中，共有125个显著的DEG被注释为“类黄酮生物合成”相关基因。在由NEC向EC过渡的过程中，类黄酮生物合成关键基因主要在NEC中表达，此外，大多数FLS和F3’H家族主要在NEC中表达，在EC中表达显著下调。11个R2R3-MYB转录差异表达。在龙眼SE期间，MYB12和MYB111在NEC中几乎没有表达，从NEC到EC表达显著上调，在SE早期保持较高水平。MYB75、MYB113、MYB4和MYB123在EC中表达显著下调，在SE早期维持相对较低表达。共有35个脂肪酸生物合成相关基因在SE过程中差异表达。

图3 类黄酮生物合成途径分析

5.胞外蛋白编码基因及SE分子标志物筛选

      已有研究表明，GLPs、AGPs、CHIs、LTPS和糖蛋白对SE起关键作用，可作为SE早期的蛋白质标志物。在本研究中，共有有16个CHI在NEC中有差异表达，其中大部分在NEC中较高表达，在EC中显著下调。大部分LTP主要在NEC中表达，从NEC到EC表达下调。同时，12个GLP和2个分泌型糖蛋白(EP1-like)主要在NEC表达，并且在SE早期维持很低的FPKM。结果表明，大部分胞外蛋白编码基因主要在NEC中表达，推测它们可能参与了NEC向EC的转变。

为了研究龙眼早期SE分子标记的全面性，本研究通过对龙眼根、茎、叶、花、花蕾、幼果、果皮、果肉和种子等9个组织中的FPKM进行比较分析，筛选出SE早期的分子标记基因。作者发现共有55个基因被鉴定为与SE密切相关的代表性分子标记，依据它们在所有测试样本中的特异性表达谱，可以分为两大类：NEC标记和SE分子标记。SE标记基因在NEC中几乎检测不到，在SE早期高表达，也可分为SE特异性基因和SE高表达基因。SE特异性基因仅在体细胞胚中高转录，包括LEC1、LEC2、WOX9、WOX2等。这些SE特异性基因可能在龙眼SE中起关键作用。SE高表达的基因与SE特异性基因相似，不同之处在于这些基因在本研究的一个或几个被测组织中也高表达，包括ABI3、FUS3、PDF1.3等。相反，28个有代表性的NEC标记基因在NEC中高表达和特异表达，包括LEA5、CNOT3等。

6.QRT-PCR验证

作者对16个分子标记在包括NEC、EC、ICpEC、GE、TE、CE在内的组织中进行QRT-PCR验证，根据qRT-PCR结果，所有选定的基因在不同发育阶段都有不同水平的表达。DlLEC1、DlPDF1.3、DlGH3.6、DlPIN1、DlWOX9、DlWOX2、DlGIF2、DlRGF3、DlPLT2和DlAGL80在NEC中几乎未检测到，在EC中表达高，然后在SE中表达下调，在TE和CE中表达相对较低，表明这些分子标记在EC的诱导和维持中起重要作用。DlL1L、DlBBM、DlABI3和DlLTP在SE过程中高表达或上调，在NEC中低表达或未发现表达，表明这些标记基因可能正向调控龙眼SE的发育。此外，DlLEA5和DlCHI的转录水平在NCE中高度特异表达，可能是NEC向EC转化的抑制因子。SE相关基因的qRT-PCR验证也显示RNA-seq和QRT-PCR数据之间高度相似。

图4 QRT-PCR验证

总结

作者研究建立了龙眼SE的高分辨率转录组数据集。对早期SE阶段表达模式的比较分析提供了调控龙眼SE的DEG亚群。揭示了植物激素相关基因如生长素和细胞分裂素信号途径、类黄酮和脂肪酸生物合成途径、胞外蛋白以及具有代表性的分子标记基因在龙眼SE中的表达谱，表明它们可能在龙眼SE中发挥作用。这些转录数据为未来的功能研究提供了新的见解。

 

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