近几年来，单细胞技术一直受期刊的偏爱。原因在于其不仅可以研究细胞之间的异质性，还可以得到基因表达谱信息，可以更加全面的解释生命活动这个复杂的动态变化过程。今天我们详细解读了一篇2022年2月发表的高分文章，希望能够给各位提供科研思路。
研究背景
慢性淋巴细胞白血病（CLL）会导致患者机体感染易感性增加，但并非均与T细胞功能障碍有关，因此，识别具有T细胞缺陷的CLL患者非常重要。前期研究已证明基因BCL-2在CLL中具有重要作用，但尚无研究证明其在CLL患者T细胞中的作用。本研究确定了BCL-2在CLL肿瘤微环境中T细胞中的调节作用。
研究材料
材料：6名CLL患者和2名健康人的血液样本，临床信息如下
方法：单细胞转录组测序
研究成果
1、CD4+ T细胞中BCL-2的表达与Treg的激活和增殖有关
单细胞测序共得到16个细胞群，其中cluster6被鉴定为CD4+ T细胞（图1a）。使用limma包分析BCL2阳性和阴性细胞中的基因表达，并使用热图和火山图绘制差异表达基因（DEG）（图1b，c）。KEGG富集分析表明，DEGs主要富集与“细胞粘附”相关的信号通路，包括“细胞-细胞粘附的调节”和“白细胞-细胞粘附的调节”，除此以外还包括“T 细胞活化”（图1d）。
图1 CD4+ T细胞中的BCL-2表达与T细胞活化、增殖相关
DEG的GSEA表明BCL2+ T细胞的Treg数量增加。此外，BCL2+ T细胞中的Treg多于BCL2- T细胞（图2e，f）。GSVA分析显示BCL2+ T细胞具有“IL-6相关特征”和“T细胞激活相关特征”（图2g）。GSEA分析观察到BCL2+ T细胞主要参与EGFR/MEK信号通路（图2h）。最后，分析了BCL2+ T细胞的代谢特征，发现BCL2+ T细胞可能与“缺氧抑制因子（HIF）调节基因”和“糖原代谢基因”有关（图2i）。
图2 CD4+ T细胞中的BCL-2表达与Treg相关
2、CD8+ T细胞中的BCL2表达与细胞毒性T淋巴细胞耗竭增加有关
Cluster 8被鉴定为CD8+ T细胞，比较了BCL2阳性和阴性CD8+ T细胞之间的基因表达（图3a-c）。KEGG富集分析表明，DEG富集在T细胞活化和细胞-细胞粘附相关的信号通路上，并且BCL2在CD8+ T细胞中的表达可能与细胞迁移、细胞毒性有关（图3d）。 CD8+ T细胞中的BCL2表达显示出T细胞衰竭特征。发现BCL2+ T细胞中耗竭CD8+ T细胞的数量显著增加，表明BCL2+ CD8+ T细胞的转录谱与耗竭T细胞相似（图3e，f）。TF预测分析与CD4+ T细胞结果相似，这表明CD4+和CD8+ T细胞可能共享相同的上游信号通路（图3g）。代谢特征分析发现HIF调节基因和磷酸戊糖途径基因与BCL2+ CD8细胞相关（图3h）。
图3 CD8+ T细胞中的BCL-2表达与细胞毒性T淋巴细胞耗竭增加有关
3、BCL-2表达与CLL患者的Th1降低和Treg升高有关
收集了70名CLL患者的PBMC样本。首先，在T细胞中检测BCL-2表达，包括T1、T2、T17、T22、Tregs和滤泡辅助T细胞（Tfh），发现BCL-2+的T1细胞百分比显著降低（图4a）；T2、T17、T22和Tfh细胞显著升高（图4b-e），T细胞中BCL-2表达对Tregs的影响较大（图4f）。研究发现T细胞中的BCL-2表达可以影响T亚群。
图4 BCL-2阳性和阴性不同谱系CD4+ T细胞的分布
4、BCL-2+ CD4+ Treg中IL-10和TGF-β上调
TGF-β在幼稚CD4+细胞分化为Treg的过程中至关重要，对于维持Treg稳态也很重要。研究发现与BCL-2-Treg相比，BCL-2+ Treg中IL-10和TGF-β的MFI显著增加（图5a-d），然而IL-35+和TGF-β+没有统计学差异，而BCL-2+ Tregs可以分泌更多的IL- 35和TGF-β（图5d，f）。
图5 BCL-2阳性和阴性CD4+T细胞中Treg分泌的细胞因子
5、BCL-2促进CLL患者的细胞耗竭并降低CD8+T细胞的细胞毒性
在70名CLL患者中研究了CD8+ T细胞BCL-2表达与其耗竭和细胞毒性之间的关联，结果发现BCL-2+细胞中耗竭CD8+T细胞的比例和MFI显著高于BCL-2-T细胞（图6a，b）。 除了导致T细胞耗竭之外，BCL-2表达增加与颗粒酶B和穿孔素的表达减少有关。此外，CD8+ BCL-2+ T细胞中颗粒酶B阳性的百分比降低，而穿孔素在CD8 +BCL-2+ T细胞保持不变，但CD8+BCL-2+ T细胞中颗粒酶B和穿孔素的MFI水平高于CD8+BCL-2-T细胞（图6c-f）。
图6 CD8+ T细胞的耗竭和细胞毒性
6、BCL-2改变CLL患者的T细胞分化
一般来说，T细胞的分化根据CD45RA和CD62L的表达可分为四个阶段，幼稚T细胞（Tn、CD45RA+CD62L+）、效应T细胞（Tef、CD45RA+CD62L-）、效应记忆T细胞 （Tem，CD45RA-CD62L-）和中央记忆T细胞（Tcm，CD45RA-CD62L+）（图7a，b）。对每个T细胞亚群中BCL-2的表达进行分析，结果表明BCL-2+ T细胞中幼稚T细胞的比例高于BCL-2- T细胞（图7c，d）。此外，BCL-2+ T细胞中Tem和Tcm的比例低于BCL-2- T细胞。
图7 CLL中BCL-2阳性和阴性T细胞的分化
7、CR患者中BCL-2+ T细胞的频率和恢复功能降低
比较了来自12名匹配的venetoclax治疗前后的CLL患者外周T细胞的BCL-2表达和功能（图8a-e），发现venetoclax显著降低了CLL患者中CD4+BCL-2+和CD8+BCL-2+ T细胞的占比（图8f，g）。 此外，venetoclax处理后，CD4+ T细胞中Tregs和CD8+ T细胞中PD1+Tim-3+细胞的百分比显著降低（图8h，i）。这些结果表明，外周T细胞中BCL-2的表达是预测治疗反应的潜在指标。
图8 CLL患者接受venetoclax治疗后BCL-2表达及T细胞功能恢复
研究结论
本研究揭示了BCL-2在CLL患者T细胞中的作用，发现BCL-2通过增强Treg分化和CTL细胞耗竭来促进免疫抑制。研究还确定了使用BCL-2抑制剂venetoclax治疗CLL的新策略，并为恢复T细胞功能提供了新的思路。
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