韩永超博士团队发现DMI类杀菌剂对炭疽菌无性繁殖的促进作用

研究背景

由真菌侵染引起的作物病害每年在全世界造成约20%的产量损失，收获后还会造成10%的损失。真菌对人类健康的影响目前呈螺旋上升趋势，真菌疾病的全球死亡率现已超过疟疾或乳腺癌，与结核病和艾滋病毒的死亡率相当。化学防治是控制引起作物和动物疾病的真菌病原体的最重要措施之一。然而，随着杀菌剂的广泛使用，出现了许多问题，其中最重要的是真菌耐药性和杀菌剂残留。目前，对于植物病原体而言，许多地区的白粉病、纹枯病、镰刀菌穗枯病和小麦赤霉病对常用杀菌剂的抗性频率已导致化学防治效果的下降或失败。在人类中，高危患者长期的预防性治疗同样会导致真菌耐药性的出现。为了提高防治效果，农民盲目提高施用频率或不加区别地使用各种登记范围外农药，这是我国农药残留和环境污染的主要来源。关于施用后杀菌剂的影响，之前的研究主要集中在农药残留对水果和蔬菜的有害影响；杀菌剂在处理后的残留,尤其是它们在目标真菌生长和产孢中的潜在作用很少受到关注。

草莓炭疽病是一种严重危害草莓生产的真菌病害，炭疽病的防治主要依靠化学杀菌剂。杀菌剂，尤其是甾醇C-14α-脱甲基酶抑制剂（DMIs）和线粒体呼吸抑制剂（QoI）广泛应用于草莓炭疽病和其它植物真菌病害的防治。本研究旨在以炭疽菌和DMIs为模型，更好地了解低剂量杀菌剂残留对真菌产孢的作用，并希望在剂量和时间方面制定最*杀菌剂控制策略。作者对低剂量杀菌剂胁迫下的炭疽菌进行了形态学和转录组学分析。

实验材料与方法

1、炭疽菌菌株：从发病草莓和山药组织中分离鉴定出108个炭疽菌菌株（Colletotrichum spp.），这些菌株分为5个种，其中89个C. siamense, 7 个C. fructicola, 5 个C. gloeosporioides, 4个C. aenigma和3个C. nymphaeae菌株。

2、杀菌剂：两种DMI类杀菌剂：苯醚甲环唑（95.0%）和咪鲜胺（97.0%），一种QoI类杀菌剂：吡唑醚菌酯（98.3%）。

3、炭疽菌对杀菌剂胁迫的形态学响应：观察108个炭疽菌菌株在含有不同种类和浓度杀菌剂的PDA培养基中生长时的形态，记录不同处理条件下各菌株的产孢情况。

4、从5种炭疽菌中选取20个代表性菌株评估杀菌剂胁迫对分生孢子产量的影响：包括 5个C. siamense, 4个C. gloeosporioides, 4个C. fructicola, 4个C. aenigma和3个C. nymphaeae。

5、DMI对炭疽菌在植株组织上产孢的影响：用C. fructicola 菌株Gwha-1接种不同浓度苯醚甲环唑处理的草莓叶片，分析植物组织上分生孢子数量的变化趋势。

6、转录组分析材料：用C. fructicola 菌株Gwha-1菌丝体做转录组，实验组：添加0.1593 µg/ml苯醚甲环唑的PDA培养基，对照组未添加任何杀菌剂，于28°C下黑暗条件下培养3天，每组取3个生物学重复样。

主要结果与分析

1、炭疽菌对杀菌剂胁迫的形态学响应

对108个炭疽菌菌株的形态观察过程中发现：在未添加任何杀菌剂PDA上于28°C黑暗中培养5天期间，除两个C. nymphaeae菌株外，所有菌株的菌落颜色均未出现明显变化。培养5天后，两个C. nymphaeae菌株在PDA上产生肉眼可见的透明粉红色菌落。苯醚甲环唑和咪鲜胺能够促进炭疽菌菌株的无性繁殖。随着苯醚甲环唑或咪鲜胺浓度的增加，更多的菌株表现出菌落颜色的变化，表明产生了更多的分生孢子。在含有7.9667μg ml^-1苯醚甲环唑或0.8080μg ml^-1咪鲜胺的PDA上，分别有85和83株炭疽菌产生粉红色菌落，表明分生孢子产量增加。然而，吡唑醚菌酯对炭疽菌在PDA上的产孢没有显著影响。说明不同种类杀菌剂对炭疽菌产孢的影响存在差异，DMI类杀菌剂对炭疽菌产孢的促进作用并不局限于某个种类的炭疽菌或某几个菌株，这种促进作用在炭疽菌中广泛存在。

2.苯醚甲环唑对炭疽菌在草莓叶片上产孢的影响

在接种后的前12天或16天C. fructicola在草莓叶片上的产孢量逐渐增加，然后下降。在接种初期（第4天和第8天），苯醚甲环唑抑制了C. fructicola的生长，导致分生孢子产量低于未经处理的对照。在接种后4天和8天时，7.9667 µg ml^-1苯醚甲环唑处理的分生孢子产量显著低于对照。苯醚甲环唑浓度为0.0319 µg ml^-1、8 dai时的分生孢子产量也显著低于对照组。然而，在接种后12天和16天时，苯醚甲环唑处理的叶片上的分生孢子产量显著高于未处理的对照。总的来说，苯醚甲环唑处理过的叶片在0.0319 lg ml^-1和7.9667 µg ml^-1下的最高分生孢子产量分别是未处理对照最高分生孢子产量的1.29倍和1.46倍。说明DMI能够促进炭疽菌在植物组织上的产孢量增加，具有影响病害田间病害流行的风险。

3、麦角甾醇生物合成途径相关的差异基因分析

在真菌中，麦角甾醇是由乙酰辅酶A（乙酰辅酶A）通过复杂途径合成的。酿酒酵母中的麦角甾醇生物合成步骤研究较为透彻，共有21个基因参与麦角甾醇生物合成。我们从C. fructicola中找到了相关同源基因。在苯醚甲环唑胁迫下，在参与麦角甾醇生物合成的基因中，与对照相比， Erg11（DMI杀菌剂的靶标，在真菌中被称为CYP51）基因被发现上调。Erg6、Erg27、Erg3和Erg5基因表达量也上调。与对照组相比，Erg4基因受到抑制。苯醚甲环唑处理后，其他15个基因的表达水平没有显著变化。说明：DMI类杀菌剂对炭疽菌产孢的促进作用可能与麦角甾醇合成途径中基因表达量的变化及甾醇种类变化有关。

4.与产孢调控有关的差异基因分析

通过局部BLAST搜索，找到了几乎所有已知与分生孢子形成有关的31个同源基因。在这些基因中，AbaA和WetA是真菌产孢的中央调节因子，几乎所有环境因子对产孢的调控均需通过中央调节因子。在苯醚甲环唑胁迫下，中央调节因子AbaA和WetA基因的表达显著增加，该结果从基因表达层面进一步验证了DMI对炭疽菌产孢的促进作用。NsdC、NsdD、PpoA、PpoB、OsaA和PpoC在发育平衡中发挥作用，苯醚甲环唑胁迫下PpoC的表达显著增加。FluG、SfgA、FlbA、FlbB、FlbC、FlbE和FlbD参与FluG介导的信号通路，苯醚甲环唑胁迫下，FlbA和FlbD的表达水平显著升高，而SfgA的表达水平显著降低。其他14个基因在光依赖性信号通路（LreA、LreB和FphA）、MAP激酶信号通路（MpkB、MkkB、SteC和SteD）、G蛋白信号通路（FadA和PkaA）、转录因子（SltA、AreA、ZipA、MtfA和RlmA）和Velvet家族蛋白（VelB和VosA）中发挥作用，这些基因的表达量在苯醚甲环唑胁迫下没有显著改变。该研究结果表明：环境DMI杀菌剂胁迫信号可能通过FluG信号通路传导至中央调节因子。

总结

在PDA培养基和植物组织上，低浓度的DMI杀菌剂能促进炭疽菌的产孢，而线粒体呼吸抑制剂（QoIs）对炭疽菌的产孢没有显著影响。转录组学分析表明，DMI杀菌剂信号可能通过FluG介导的信号通路传递到中央调控通路，进一步证实了DMI杀菌剂促进炭疽菌产孢的形态学效应。

研究结果表明，杀菌剂对病原真菌的生长和繁殖具有双向作用，本研究为科学合理地使用杀菌剂提供了新的依据。