全长微生物多样性+代谢组联合分析助力发现细菌接种剂与蔗糖改良剂带来的细菌群落变化与R.palmatum L.生长之间的关系

文献信息

期刊：International Journal of Molecular Science

影响因子：5.923

发表时间：2022.02.01

合作单位：中国科学院西北生态环境资源研究院

研究方法：全长微生物多样性（16S+ITS）

摘要

2022年2月，中国科学院西北生态环境与资源研究所在《International Journal of Molecular Science》发表题为“Bacterial Inoculant and Sucrose Amendments Improve the Growth of Rheum palmatum L. by Reprograming Its Metabolite Composition and Altering Its Soil Microbial Community”的研究论文，该论文主要研究了（1）细菌接种剂和蔗糖联合使用对R. palmatum L.的影响；（2）联合接种对土壤性质和土壤微生物的影响；（3）联合接种后根际微生物变化及其与R. palmatum L.生长变化的关联。

研究背景

根际被定义为与植物根系相关的狭窄土壤区域（<2mm），它是土壤肥料核心PGPM（Plant Growth-Promoting Microbes，促进植物生长）定植的地点，与植物生长发育具有重要关联。Bacillus是目前最为广泛报道的PGPM，可通过直接作用促进植物生长，如产生生物化合物（例激素吲哚-3-乙酸（IAA）以及亚精胺等），还可以通过微生物之间的协同及拮抗作用间接促进植物生长。但是由于土壤通常是碳限制状态，在这样的情况下，只有不到5%的细菌处于活跃状态，通过向土壤中添加蔗糖等小分子碳可以影响细菌的直接能源，从而促进PGPM效应。

R.palmatum L.是一种传统的中药材，中文名称为“大黄”，它具有悠久的历史及宝贵的药用价值。目前，尽管为其开通了人工种植的方法，但是病虫害的频繁爆发和各种疾病的发生，加上有效药材含量较低，是威胁其长期生产的主要问题。为了解决以上问题，文章从植物的栖息地土壤出发，考虑了微生物接种剂对种植土壤的改良作用，同时还考虑了蔗糖改良剂促进植物生长的作用，在此基础上，根际土壤在两种联合接种剂下的变化及土壤根际微生物群落变化与植物生长变化之间的关联也被探明。因此，这项工作不仅在经济植物中具有广泛的应用前景，而且强调了可持续农业的农业生态实践。

研究方法

实验设计：

①实验材料：R.palmatum L.幼苗，B. amyloliquefaciens接种剂EZ99，蔗糖

②实验梯度：EZ99（1.0×10⁵、1.0×10⁶和1.0×10⁷CFU/mL，此处分别用 LB、MB和HB 表示）；

蔗糖（0.15、1.5和15 g/L，分别表示为LS、MS和HS）

③实验分组：水对照（CK）、仅细菌接种剂（LB、MB、SB）、仅蔗糖（LS、MS、HS）和细菌接种剂+蔗糖组合（ LB + LS、LB + MS、LB + HS、MB + LS、MB + MS、MB + HS、HB + LS、HB + MS和HB + HS）

④田间实验：设置为RCB（Randomized Complete Block），每个分组含有三个重复区块，移植后约1个月，对幼苗（n = 2400）进行根部接种，每株施1L处理土壤，2周后再次施用

实验方法：

①生长参数和产量分析：

处理三周后，每月记录植物高度 (cm)、冠宽 (cm)、叶长 (cm) 和叶宽 (cm) 的变化；

收获后根系产量参数：包括主根长（cm）、总根长（cm）、主根直径（cm）、侧根数、鲜根重（g）、干根重(g)

②土壤理化性质、酶活性和微生物量的测定：

土壤理化：总碳（TC）、总氮（TN）、硝氮（NH₄-N，AN）、氨氮（NO3-N，NN）、总磷（TP）、有效磷（AP）、总钾（TK）、有效钾（AK）

土壤酶活性：土壤蔗糖酶（S-SC，EC3.2.1.26）、脲酶（S-UE，EC3.5.1.5）、酸性磷酸酶（S-ACP、EC 3.1.3.2）和碱性磷酸酶（S-AKP ，EC3.1.3.1）

微生物量：微生物生物量碳 (MBC) 作为土壤微生物生物量 (SMB) 的代表

③代谢组学分析：

植物组织样品的广靶代谢组研究

④微生物测序：

根际土壤的全长微生物多样性（16S和ITS）

主要研究结果

1. PGPM和蔗糖应用对R.palmatum L.生长和产量的影响

R. palmatum L.在不同生长时期（7、8、9、10月）的生长参数如图1所示。与对照组（CK）相比，任意三种浓度的细菌接种剂（LB、MB和HB）处理后的株高、冠宽、叶长和叶宽都有所增加。我们的结果显示了两个明显的倒V形趋势，在四种含 LB 的处理（LB、LB + LS、LB + MS和LB + HS）中出现了一个外峰。尽管HB处理增加了R. palmatum L.的生长，但当与蔗糖结合时，它降低了生长，尤其是在 HB + HS 处理下。这表明用高水平蔗糖（15 g/L）修正的高水平细菌接种剂（1.0 × 10⁷CFU/mL）抑制了PGPM的植物促生长功能。

在收获时，还确定了地块产量的变化（图2）。与两个明显的倒V形趋势的生长结果一致，LB + LS和LB + MS处理下的R. palmatum L.根的鲜重得到了最显著的改善（图2A）。我们进一步分析了主根和侧根的变化（图2B-D），发现在LB+MS下获得最大的根长和侧根数，而在LB+LS下获得最大的主根直径，这意味着 LB + MS处理刺激侧根的数量和长度，而LB + LS促进主根厚度以提高R. palmatum L.的根重。

图2 PGPM和蔗糖在收获阶段对R. palmatum L.根系的影响

2. PGPM和蔗糖处理下R. palmatum L.根的代谢差异

重点放在LB+LS的结合分组，通过广靶代谢组学探索促进植物生长的潜在机制（图3A）。共对12个新鲜的根样品进行了表征，鉴定了800种带注释的代谢物，主要由38种羧酸及其衍生物、15种有机氧化合物、14种脂肪酰基和 11种有机氮化合物组成。使用 GC-TOF-MS的全局靶向代谢组分析方法进行相关偏最小二乘判别分析 (PLS-DA)，如图所示（图3B），三个生物配对之间的 Spearman相关系数均超过0.94，这表现了实验的高重现性。然后通过PLS-DA评分图来评估这些植物组织样品之间的差异（图3C），结果显示出了分组之间的明显分离。此外，对潜在结构判别分析（OPLS-DA）建模的监督正交投影也揭示了这些分组植物组织样本代谢组比较中的显著差异。

通过VIP（Variable Importance in Projection ） ≥ 1、倍数变化 ≥ 1.5 和 p 值 ≤ 0.05 的筛选标准，显著鉴定了 38、39、53、47、64 和 49 种差异表达代谢物 (DEMs，Differentially Expressed Metabolites )分别在 CK vs.LS、CK vs.LB、CK vs.LB + LS、LB vs.LB + LS、LS vs.LB + LS 和LS vs.LB（图4A）。

最多的DEMs是在LS与LB + LS对中，共有26个上调和38个下调。相应的维恩图说明了所有比较对中独特和共享的DEMs（图4B）：显然，所有六个比较对仅共享一个DEM（N-肉桂酰血清素），这意味着这种代谢物是必不可少的。具体而言，分别在 CK vs.LS、CK vs.LB、CK vs.LB + LS、LB vs.LB + LS、LS vs.LB + LS以及LS vs.LB中分别发现了30、23、26、24、18和22个DEMs 。

图3  R. palmatum L.广靶代谢组学的评估 (n = 3)

(A)PGPM和蔗糖处理下大黄的外观(B)R. palmatum L.代谢谱的相关热图(C)偏最小二乘判别分析 (PLS-DA)

为了揭示与蔗糖和PGPM应用相关的全部代谢物，通过热图进一步比较了 LS、LB和LB + LS处理与CK的DEMs。如图4C所示，R.palmatum L.的主要成分8种蒽醌在三个比较中被差异鉴定。相对于CK，LS组积累了最高水平的大黄素-3-O-硫酸盐和芦荟大黄素-1-O-葡萄糖苷，但减少了1-羟基-3-甲基蒽醌水平。LB + LS组积累了最高水平的金黄色素-6-O-葡萄糖苷和托拉克松-8-O-葡萄糖苷，但降低了托拉克松和漆酸D的水平，而LB组仅积累了2-乙酰氧基甲基-蒽醌。对于六种香豆素，它们在处理下都显示出下调的水平，相比之下，苯丙烷类仅在 LS处理的大黄中发生变化，3，6-二亚甲基蔗糖上调，阿魏酰酒石酸下调。

同时，通过代谢组鉴定了许多类黄酮，包括黄酮和黄酮醇，在LS或LB 处理下，这些物质在R.palmatum L.中高度表达，但在LB + LS中的水平下降。另一大类是酚类化合物，其在LB + LS 组中的积累达到高水平，值得注意的是，白藜芦醇-3-O-硫酸盐（一种二苯乙烯）在LB处理下高度积累。此外，对于碳水化合物和有机酸，在LS和LB处理下观察到糖类的整体上调，而在LB + LS处理下有机酸的下调是明显的。

然后对KEGG中的DEMs进行了代谢富集分析，结果表明醚脂质代谢 (ko00565)、淀粉和蔗糖代谢 (ko00500) 和糖酵解/糖异生 (ko00010) 作为 LS 处理的R.palmatum L.显著富集的途径。嘧啶代谢 (ko00240)、精氨酸和脯氨酸代谢 (ko00330) 和C5分支二元酸代谢 (ko00660) 则是LB处理的R.palmatum L.显著富集的途径。氨基酸生物合成 (ko01230)、2-氧代羧酸代谢 (ko01210) 和精氨酸生物合成 (ko00220) 是LB + LS处理的R.palmatum L.显著富集的途径。

图4 PGPM和蔗糖处理（n = 3）下对棕榈树进行广靶向代谢组学分析 （A）每次比较中差异表达代谢物 (DEM) 的数量 （B）维恩图描绘了所含DEM数量和重叠DEM的数量 (C) 样本中DEM的热图分析

3. PGPM和蔗糖处理下的土壤性质、酶活性和微生物量

土壤 pH 值、土壤含水量 (SWC)、土壤有机质 (SOM)、总碳 (TC)、总氮 (TN) ) 和碳氮比(C/N)比相当稳定，无论是在根际和大块土壤中，在铵态氮 (NH₄-N) 方面也是如此。

然而，与根际土壤相比，大块土壤中的硝酸盐氮（NO₃-N）异常高（33.19 ± 2.98 mg/kg），这表明根际微生物对氮的利用率很高。此外，HS根际土壤中有效磷和总磷的量显著增加，这表明在没有任何PGPM的情况下添加高蔗糖可能提供了磷转化所需的碳。LB + LS处理显著增加了总钾并降低了速效钾，这表明根际土壤中钾的利用率有所提高。普遍增加的碳和营养物质的可用性也将刺激微生物活动，而酶活性水平的提高证实了这一点（图5）。

LB + HS根际土壤的理化性质与其他处理的土壤没有显著差异，然而，添加PGPM和蔗糖后，脲酶(S-UE)酶的活性趋于下降。这些结果表明，LB + LS处理中PGPM和蔗糖的共同作用并没有导致土壤养分总含量的显著净差异，但它们显著增加了总钾的含量，这可能调节了土壤中钾和养分循环的生物有效性。

图5  PGPM和蔗糖处理的土壤酶活性（n = 3）和微生物生物量碳（n = 6） 其中：S-SC，蔗糖酶；S-UE，脲酶；S-ACP，酸性磷酸酶；S-AKP，碱性磷酸酶；MBC，微生物生物量碳

 4. PGPM和蔗糖应用对根际微生物群落多样性和丰富度的影响

生成了基于16S rRNA 基因的细菌测序和基于ITS rRNA 基因的真菌测序图谱，以更好地揭示大黄根际的微生物群落组成。使用 97%的核苷酸序列同一性，将这些序列分为1685个细菌OTU和492个真菌OTU，其中CK根际细菌OTU丰度最高（1582），其次是LB + LS（1562）、LB（1549）、和LS (1499)处理，而LS根际的真菌OTU数量(347)最高，其次是CK (325)、LB (314) 和LB + LS (301) 处理(图6A，B)。维恩图表明CK、LS、LB和LB + LS处理分别有5、4、17 和 2 个共享的OTU，在细菌群落中共有1263个OTU。在真菌群落中，CK、LS、LB和LB + LS处理分别有16、27、24和31个OTU，共享了150个OTU（图6A，B）。

PLS-DA分析显示，四种处理（CK、LS、LB 和 LB + LS）的样品在细菌群落（分别占总变量的 12.64% 和 8.64%）和真菌群落中均分离良好（分别占总变量的 11.35% 和 8.58%）（图 6C，D）。对于细菌，处理后的α多样性虽然与CK相比差异不显著，但丰富度指数（Ace和Chao1）和多样性指数（Simpson，Shannon，PD Whole Tree除外）在处理中都减少了，特别是在LS土壤中。然而，CK和LB + LS之间的Simpson Index存在显著差异（p = 0.0147）。

对于真菌，与CK相比，LS保持较高的丰富度（Ace和Chao1），而LB + LS 和LB的含PGPM处理的任一指数值都较低。与CK相比，Simpson和Shannon多样性指数在所有三种处理下都有所增加，而LB + LS的PD Whole Tree显著降低（p=0.0808）。因此，添加蔗糖的LS降低了细菌的丰富度和多样性，而包含PGPM的LB + LS和LB降低了丰富度，但诱导了更多的真菌多样性。

5. PGPM 和蔗糖应用对根际微生物群落组成的影响

进一步分析微生物群落结构表明，16S rRNA基因序列隶属于31门257科396属，而ITS rRNA基因序列隶属于8门100科170属。图7显示了在群落组成中发现的15个最丰富的门和目，以及前20个属。Proteobacteria，Bacteroidetes，Acidobacteria和Planctomycetes是所有样品中最主要的四种细菌门（图7A），占所有分类细菌序列相对丰度的67.8-71.68%。Proteobacteria是CK、LS和LB +LS 土壤中的主要细菌门，而Bacteroidetes (23.4%) 是LB处理土壤中最高的门，其次是Proteobacteria (20.6%)。这表明PGPM修正后的土壤细菌群落与蔗糖处理 (LS) 或 CK 后的土壤细菌群落显著不同。此外，LB和LB + LS处理的样品中Cyanobacteria的相对丰度增加，而CK和LS样品中的Rokubacteria增加。

在目水平上，Chitinophagales含量最高，uncultured_bacterium_c_Subgroup_6、Tepidisphaerales、Cytophagales、Betaproteobacteriales和Sphingomonadales紧随其后，它们是所有样品中土壤中存在的六种最主要的细菌。在这六个目中，与CK和LS相比，LB处理的土壤中的 Cytophagales和Saccharimonadales含量最高。这两种处理的土壤不仅在目水平上而且在属水平上都含有相似的细菌组成。特别是，LB 处理和PGPM施用于土壤时，uncultured_bacterium_c_Subgroup_6的相对丰度降低，而uncultured_bacterium_o_ Saccharimonadales的相对丰度增加。总之，我们的结果表明，添加蔗糖对LS土壤中的细菌群落结构影响不大，但它调节了LB + LS土壤中添加 PGPM 诱导的多样性。

图7 在蔗糖和PGPM处理下，门、目和属的分类水平上，根际土壤中细菌 (A) 和真菌 (B) 群落的相对丰度

在分类的真菌群落中（图7B），Ascomycota和Mortierellomycota是两个最丰富的门，合计占总真菌序列相对丰度的92.5% 以上。最丰富的Ascomycota在CK (79.1%) 处理中富集最多，在 LB + LS (71.6%) 处理中减少最多。相比之下，在 LB + LS 处理下，通常排名第二的Mortierellomycota的丰度更高。此外，第三丰富的Basidiomycota似乎对添加蔗糖很敏感。有趣的是，Chytridiomycota的相对丰度在LS和LB处理中降低。在目水平上，Hypocreales最为丰富，接下来依次是Mortierellales、Sordariales、Pezizales、Glomerellales、Chaetothyriales 和 Pleosporales，它们是最主要的七种真菌。与CK相比，Hypocreales在所有处理中均下降。值得注意的是，尽管在LS和LB处理的土壤中Pezizales增加，但其丰度出乎意料地在LB + LS处理下最低。在属水平上，与CK相比，所有处理的第一优势属Fusarium减少，而第二优势属Mortierella增加，其中LB+LS处理的增幅最大。简而言之，与细菌群落不同，真菌群落结构在 CK 与三种处理之间甚至在不同处理之间均发生了明显变化。

6. 土壤理化性质对微生物丰度的影响

根据选定的土壤理化性质和门和物种水平的前10种微生物丰度进行了RDA分析（图 8）。结果表明，共可以解释细菌总变异的42.11%（门）和31.85%（种），可以解释真菌总变异的62.68%（门）和26.85%（种）。

门水平上，总细菌群落的结构与某些土壤理化性质密切相关：TC、TK、PH和NH₄-N（图8A）。LS土壤以Proteobacteria、Gemmatimonadetes和Planctomycetes为主，与TC和NH₄-N最相关，LB处理的土壤以Bacteroidetes、Patescibacteri和Verrucomicrobia为主，这些与TK和pH最相关，而 LB + LS 土壤以Verrucomicrobia、Chloroflexi和Acidobacteria为主，它们都与土壤TK和NH₄-N 相关。因此，土壤理化性质与优势菌种的相对丰度之间的关系表明，pH、TC、NO₃-N 和TK是影响环境因素（图8C）。RDA结果还表明Nitrospira和Pontibacter的相对丰度与TK含量相关，但与LB处理的土壤中的TC呈负相关。Flavisolibacter和Pontibacter的相对丰度均与 LB + LS土壤中的pH值相关，而Sphingomonas的相对丰度与 AK和TC相关。

图8 蔗糖和PGPM处理下门（A,B）和种（C,D）水平的RDA图

对于门水平的真菌，总群落组成与以下土壤理化性质密切相关：TK、NH₄-N、TC、pH和TP（图8B）。LS土壤以Rozellomycota和Mortierellomycota为主，其成员与TK和TP相关性最高，LB处理的土壤以Mortierellomycota、Zoopagomycota和Mucoromycota为主，与 TP、TN和SOM相关性最高，以及LB + LS土壤以Basidiomycota和Chytridiomycota为主，它们与土壤pH和C/N有关。

土壤理化性质与种水平优势真菌相对丰度之间的关系表明，影响群落的主要环境因素是TP、TN、AP、AK、TC和NO₃-N（图8D）。RDA结果还表明，在 CK和LB处理的土壤中，Fusarium_equiseti丰度与TK和NO₃-N含量相关，Fusarium_domesticum和Humicola_nigrescens的相对丰度与LS处理下的NO₃-N 含量相关，对于Paraphoma_rhaphiolepidis、Botryotrichum_domesticum和 Mortierella_rishikesha，它们的相对丰度与 LB + LS 土壤中的SOM和pH值相关。

7. PGPM和蔗糖应用对根际微生物群落功能的网络分析及影响

对最丰富的属之间的Spearman相关系数进行网络分析（图9），显示出50个主要细菌和真菌属之间的相关性。

其中，对于细菌的属水平而言，uncultured_bacterium_o_Actinomarinales和 uncultured_bacterium_o_Subgroup_7 是最正相关的属（rs = 0.42），而在真菌群落网络中，最正相关的属是Chaetomium和Tetracladium（rs = 0.42）。

图9 基于相关性的细菌(A)和真菌(B)群落网络分析

基于16S rRNA基因土壤细菌组成数据，使用COG功能分类来预测功能分布和丰度。与CK土壤相比，我们发现 LS、LB 和 LB + LS 处理分别富集了18、23和17个途径。在这些比较中，LS土壤样品中的氨基酸转运和代谢、翻译、核糖体结构和生物发生、细胞壁/膜/包膜生物发生以及无机离子转运和代谢显著富集。在LB处理下，辅酶转运与代谢、信号转导机制、核苷酸转运与代谢均显著富集。最后，LB + LS样品中的碳水化合物转运和代谢、复制、重组、无机离子转运和代谢、翻译后修饰、蛋白质周转和分子伴侣均显著富集。

总 结

（1）共同施用蔗糖和细菌接种剂的新方法能够显著提高R.palmatum L.的数量和质量，并刺激根际启动；

（2）代谢组查明了施加影响后根际土壤和微生物代谢后差异，指明了影响植物生长的潜在路径；

（3）通过全长微生物多样性的分析发现微生物特征与植物生长有着密切联系；

（4）将环境因子与代谢组和微生物多样性联合分析，揭露了影响植物生长的因素。