分类： 医学研究, 时空组学
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研究背景

中枢神经系统（CNS）无论是急性（例如创伤性损伤）还是慢性（例如神经退行性疾病）的损伤，都会导致不可逆转的神经元损害甚至死亡，而那些存活下来的神经元有的能长出新的轴突并重新建立突触连接。该研究通过单细胞转录组揭示了与视神经挤压 （ONC）后小鼠视网膜神经节细胞（RGC）的选择性恢复能力相关的差异表达程序。

实验方法

材料：成年小鼠（n=10）眼球中分离的视网膜神经节细胞（RGC）

方法：单细胞转录组测序、免疫组化、FISH、转录组测序

研究结果

1、视网膜神经节细胞（RGC）类型分析

通过荧光分选（FACS）从成年（产后56天）小鼠眼、球中分离出RGC，进行scRNA-seq分析（图 1A），共获得35,699个细胞，分为45个cluster（图 1C），45个cluster的相对丰度从0.15%到8.4%不等（图 1D）。45个cluster都表达泛RGC标记，例如Slc17a6、Rbpms和Pou4中的至少一个（图 1E），45个cluster top2差异基因（DE）如图1F所示。

图1 scRNA-seq揭示成年小鼠45种不同的RGC类型

2、结合scRNA-seq和形态学共同定义RGC类型

利用FISH和IHC技术对视网膜中RGC进行标记和定位，发现不同的视网膜层具有不同的视网膜细胞，例如特异性表达Gpr88和Fam19a4的C10和C24在内丛状层（IPL）的S2和S4中，而表达Slc17a7的C25仅在S5中（图 2A）。

通过scRNA-seq和形态学对视网膜进行双重验证。结果发现aRGC为C41-43、45这4个cluster（图 2B）；之前的研究仅确定了4个T-RGC和4个F-RGC类型，但单细胞揭示了每个亚类中的第5种类型（分别为C9和C32；图 2C和2D）；同时ipRGC也发现了M1（C33和40）、M2（C31）和 M4（C43）类型的标记（图 2E）；ooDSGC中大部分是Cartpt+，通过Mmp17的表达确定了N-ooDSGC；C16表达的Col25a1，是D-和V-ooDSGC的marker。最后CALB1+细胞是D-ooDSGCs ，CALB2高表达细胞是V-ooDSGC（图 2F-2H）。已知RGC子类与cluster存在部分重合，每种cluster不超过两个子类。子类与cluster重合表达的基因如图2J，如：4/5 T-RGCs （Tbr1+）、4/5 F-RGCs （Foxp2+）、5/9 T5-RGCs （Tusc5+）、4/5 ipRGCs（Opn4+）和3/4 aRGC（Spp1+）。另外还鉴定到了新的子类：如8个表达转录因子Neurod2和Satb2的cluster被化为N-RGC等。其余11/45类型未分配到子类，但它们确实表现出与其他类型的相关性。


图2 scRNA-seq簇与RGC形态学类型的对应关系

3、不同RGC类型对ONC的敏感性差异很大

以RGC图谱为基础，评估了不同细胞类型对ONC的弹性（图 3A）。在ONC后14天对~8,500个RGC进行分析，此时~80% RGC已经死亡（图 3C），该研究使用iGraphBoost对细胞进行分群（图 3B），iGraphBoost可以将89%损伤的RGC分配到各个cluster中（图 3C）。损伤后第14天所有cluster表达的marker基因同1F（图3D）。与对照相比，将14dpc不同RGC类型的存活率按从高到低排列（图 3E），不同RGC类型在14dpc时表现出不同的存活率，范围从1%到98%不等。比较转录组测序和IHC对细胞活率的结果，结果高度一致（Pearson r = 0.97）（图 3H）。这些数据表明不同RGC对伤害的不同反应。所有ipRGC（Opn4+）都是有弹性的，所有N-RGC类型都是易受影响的（图 3F）。之前被定性为弹性子类的aRGC中，C42，43具有很高的弹性，但C41，45相对容易受到影响（图 3F）。同样，稀有和丰富的类型都可能具有弹性或脆弱性（图 3G）。因此，基因表达或RGC子类都不是判断细胞是否是弹性的完美因子。


图3 损伤后RGC的scRNA-seq分析

4、损伤后RGC的存活率定义了三个生存组

在ONC后的前3天内，很少有RGC死亡，在接下来的5天内死亡约70%，28dpc时逐渐下降到约10%（图 3I）。根据它们的损失动力学，将RGC类型分为三组：7个cluster是有弹性的类型，在14dpc时达到约50%的存活率；11个cluster是“中间”类型，在4到7dpc之间表现出显著下降；27个cluster是脆弱类型，4dpc时显著减少（图 3J-3M）。因此，中间和脆弱RGC（分别为intRGC和susRGC）的存活率在4dpc时显著不同（susRGC：39%±21%；intRGC：95%±25%）。

5、ONC后的基因表达谱

为了研究RGC中激活损伤反应，对ONC后的RGC进行基因表达谱分析，确定了771个在不同类型之间的DE基因，通过k均值聚类（图 4A）划分为8个模块（Mod1-8），识别具有不同时间动态的基因集，这些基因集富集在不同的GO功能中，例如在0.5dpc开始下降的模块1（Mod1）中的基因富集在健康神经元相关的GO功能中，如动作电位、突触囊泡胞外/内吞作用和逆行轴突运输（图 4B）。相比之下，在Mod5和Mod6中的基因与细胞凋亡和应激途径相关（图 4C）。DE基因几乎没有表现出强烈的类型特异性差异，但ipRGC类型除外，Mod5、6和7中C22、C31、C33和C40中的基因的上调明显低于其他类型（图 4D和4E）。


图4 scRNA-seq揭示促进RGC神经保护的衍生候选物

6、单细胞技术确定与神经保护相关的基因

尿皮质素（Ucn），它编码来自促肾上腺皮质激素释放因子家族的肽；促肾上腺皮质激素释放激素结合蛋白（Crhbp）。ONC后Ucn仅在aRGC中上调，而Crhbp在ONC前后susRGC中表达（图 5A和5B）。过表达Ucn，注射Ucn重组蛋白，通过CRISPR和两种不同的sgRNA敲除Crhbp，结果发现四种方式都显著增加RGC的存活率（图 5C和5J）。随后又验证了几对基因的表达和功能富集情况，结果与Ucn和Crhbp类似。说明可以通过对基因的干预来保护部分脆弱的RGC类型。

 


图5 影响RGC生存的基因

总结

该研究分析发现不同类型的视网膜神经节细胞（RGC）对轴突损伤的耐受性不同，一些基因可改善视神经挤压（ONC）后神经元存活和轴突再生。这项研究提供了分析损伤类型特异性反应的实例，并证明了差异基因表达可用于揭示干预的分子靶标，本文方法还可用于鉴定新的神经保护机制。

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