代谢组学是定量描述生物体内源性代谢物质的整体及其对内因和外因变化应答规律的科学，是继基因组学、转录组学、蛋白质组学之后提出的一门新的学科。代谢组学是对生物体在某一特定时期（如：病理生理刺激、不同发育状态等），体内所有代谢物进行定性与定量分析。其研究对象大多是相对分子质量小于1000 Da（或者1500 Da）的内源性小分子，包括：胆固醇、脂类、氨基酸、碳水化合物、有机酸等等。
代谢组学在癌症疾病中广泛应用。癌症代谢组学研究的核心焦点是生物标志物发现。非靶向代谢组学已被用于鉴定有意义的肿瘤标志物，并且已经发现了许多潜在的标志物，用于在不同阶段诊断和预测多种类型的癌症。非靶向代谢组学无偏向地检测样本中所有能检测到的代谢物分子，是通过生信方法进行差异分析和通路分析，寻找生物标志物，初步建立模型或代谢物Panel法。例如，在肾癌的早期诊断中，由于尿液和肾脏的密切的相互作用，研究人员使用代谢组分析癌症和健康尿液样品，发现酰基肉碱，喹啉酸，4-羟基苯甲酸，和龙胆有积累。在结直肠癌中，癌症患者和正常对照的血清样品的代谢谱分析让四个代谢物（2-羟基丁酸盐，天门冬氨酸，犬尿氨酸的选择，以及胱胺）可以作为早期诊断模型的基础。关于生物标志物，代谢组学在在肝癌，乳腺癌，卵巢癌等癌症中都有应用。
今天通过文献来见证一下非靶代谢组学在癌症研究中的非凡效果，认识非靶代谢组在癌症中寻找标志物的重要性。
文献一
从组织中筛选肝癌诊断标志物
材料与方法：
研究材料：组织以及血液样本
研究方法：非靶代谢组学+靶向代谢组学；内部验证+外部验证
技术路线：
研究结果：
1）发现阶段-标志物初筛
利用非靶向代谢组学技术对50例肝癌患者的癌组织（HCT）与近端癌旁组织(ANT)以及远端癌旁组织(DNT)组织样本中的代谢物进行LC-MS检测分析，通过多元变量统计分析发现癌组织与近端以及远端癌旁组织样本之间区分明显（图1），即癌组织与近端以及远端癌旁组织的代谢表型差异显著。
对检测到的代谢物，进行差异筛选，筛选得到105个显著性差异的代谢物，通过注释分析发现这些差异筛选到的差异代谢物主要是脂肪酸、氨基酸、糖、胆汁酸、磷脂等物质，通过KEGG代谢通路分析表明差异代谢物主要是参与糖酵解通路、TCA循环、氨基酸代谢以及脂肪酸代谢通路，表明肿瘤细胞表现出更加旺盛的能量需求。
2）血液样本的再筛-标志物确认
为了更一步分析癌组织与癌旁组织筛选到的差异物是否具有作为临床诊断的潜力，对血液样本进行非靶代谢组学分析，寻找在组织和血液中共有的在组织样本差异表达的代谢物。从血液和组织样本的共同差异代谢物中初筛标志物。为了从差异物中找到可以与AFP互补的标志物，与常用的肝癌诊断标志物甲胎蛋白（AFP）进行相关性分析，在差异物与血浆中的AFP进行皮尔森相关性分析（Pearson correlation analysis），找到了8个与AFP不相关的差异物。8个候选的诊断标志物中进一步通过筛选到了2个候选诊断标志物（甜菜碱、丙酰肉碱）。如下图所示，这两个标志物在肝癌患者中的相对表达量显著下调，组合在一起能够对肝癌和慢性肝病（298例样本）能够进行良好的区分（ ROC AUC=0.982），明显优于甲氧蛋白AFP的诊断能力（ROC AUC=0.697）。
3）验证阶段-标志物验证
为了评价和验证筛选出的差异物是否具有良好的诊断能力，进行内部验证，即将发现队列的298例样本中的一部分样本作为训练集（training set）用来构建诊断模型，剩余的样本作为测试集（test set）用来测试筛选出的标志物的诊断能力。结果如图所示：在训练集中，模型对慢性肝病和肝癌诊断的准确性分别达到91.6%和96.8%，表明模型建立良好。在测试集中，模型对慢性肝病和肝癌诊断的准确性分别达到94.2%和93.5%，表明筛选到的标志物诊断能力良好。
内部验证通过之后对其他来源的样本进行外部靶向检测，进一步用来排除假阳性和评价标志物的诊断能力。对47例（22例肝炎、22例肝癌）血液样本中的甜菜碱、丙酰肉碱进行靶向代谢组学检测，结果表明甜菜碱、丙酰肉碱均在肝癌患者中呈显著的下调，与之前的非靶测试测试结果一致，排除了假阳性。甜菜碱、丙酰肉碱组合进行疾病诊断准确率可以达到80%以上，具有临床应用的价值。
研究结论：
甜菜碱、丙酰肉碱组合能够对肝脏疾病进行良好的预测，可以作为临床肝癌的诊断标志物甲胎蛋白AFP的补充诊断手段。
文献二
从尿液中筛选肺癌诊断和预后标志物
材料与方法：
研究材料：尿液以及组织样本
研究方法：非靶代谢组学+靶向代谢组学；内部验证+外部验证
技术路线：
研究结论：
研究者收集肺癌患者和健康患者的尿液以及组织样本，通过非靶代谢组学+靶向代谢组学，内部验证+外部验证方法筛选得到这四种 NANA; cortisol sulfate; creatine riboside 和 561+代谢物与疾病的相关性，证明了它们临床应用的价值。
总结
这两篇文章的研究套路是遵循非靶向分析+靶向代谢分析，内部验证+外部验证的原则。
1）研究思路
非靶向代谢组分析+靶向代谢组分析：非靶向代谢组，借助于LC-MS组学的高通量分析能力获取大量数据, 适用于前期筛选潜在的标志物;靶向代谢组学分析, 即对非靶筛选出来的特定代谢物进行特异性检测，适用于后期对候选标志物进行验证，排除假阳性的结果。
内部验证+外部验证：标志物筛选出来后需要做进一步的验证和评价来断标志物的诊断能力。一般是通过训练集和测试集对发现队列的进行内部验证，也可以结合其他来源的样本进行外部验证，动物实验或者细胞实验。
通过非靶加上靶向验证的实验设计可以使文章的逻辑更为严密，说服力更强，结论更加可靠。为临床以后这种biomarker筛选提供好的思路，筛选得到真正有望应用于临床的biomarker标志物。
2）样本的选择
代谢组学经过了数十年的发展，大部分疾病的代谢谱特征都被公开报导了，因此如果想以此研究思路进行疾病的筛选标志物，那么研究疾病的选择一定要有稀缺性（稀有疾病或样本很难获取的疾病或者不同疾病分型），同时要兼具一定的样本规模（小样本发现阶段，大样本进行验证阶段）。
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参考文献:
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[2] Qiang Huang, Yexiong Tan, Peiyuan Yin, Guozhu Ye, Peng Gao, Xin Lu, Hongyang Wang and Guowang Xu,Metabolic Characterization of Hepatocellular Carcinoma Using Nontargeted Tissue Metabolomics. Cancer Res August 15 2013 (73) (16) 4992-5002; DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-13-0308.
[3] Armitage E G, Ciborowski M. Applications of metabolomics in cancer studies. Metabolomics: From Fundamentals to Clinical Applications. Springer, Cham, 2017: 209-234.
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