在中心法则中，RNA处于重要的中央枢纽地位，转录组作为生信科研中的“万金油”，几乎可以与所有的组学产品联合分析。转录组代表了基因表达的中间状态，可以反映诸如转录调控、转录后调控的机理；蛋白组代表生物体直接功能执行状态，可以反应转录本真实的表达情况；而代谢组可以反映生物体表型的状态变化。转录组+蛋白组+代谢组的多组学分析可以同时实现从“因”和“果”两个层面来探究生物学问题，相互间进行验证，从海量的数据中筛选出关键基因、蛋白质及代谢通路，解释生物过程的复杂性和整体性，提高文章的水平。今天小编通过一篇案例的解析，带领大家进入多组学联合分析的新视野。
英文题目：Multiomics Analysis Reveals New Insights into the Apple Fruit Decline under High Nitrogen Conditions
中文题目：多组学联合分析揭示了高氮条件下苹果果实品质下降的新见解
发表期刊：Journal of agricultural and food chemistry
影响因子：5.279
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33945277/
研究背景
水果质量是消费者偏好的最重要指标，包括各种质量特征，如水果颜色、甜度、风味和健康价值。水果的甜度取决于各种糖和糖醇的浓度和组成。此外，次生代谢产物，特别是黄酮类化合物，被认为是人类日常消费的重要物质，可以降低癌症和心血管疾病的风险。
在中国，过量施用氮肥已成为一种普遍现象，苹果树种植中施氮量已达600−800 kg/hm2，远远超过苹果树的需求。虽然高氮对提高产量和单果重有积极作用，但过量的氮会影响C−N平衡，对可溶性糖、类黄酮等果实品质指标产生负面影响。以往的研究主要集中在氮胁迫对苹果叶片的影响上，而高氮对苹果果实初级代谢和次级代谢影响的研究相对较少。本研究通过转录组学、蛋白质组学和广靶代谢组学的联合分析，探索过量氮营养与初级和次级代谢物积累之间的关系，特别是C-N平衡中碳水化合物、氨基酸和黄酮类化合物的变化，并为提高苹果果实品质提供新的见解。
材料方法
实验材料：红富士苹果（7龄；中国东北部山东省烟台市）。对照组CK：正常尿素处理组（300 kg N/hm2，每棵树435 g尿素）；实验组MHN：中高氮处理组（600 kg N/hm2，每棵树870 g尿素）；实验组HN：高氮处理组（800 kg N/hm2，每棵树1160 g尿素）。在开花后183天进行13C标记。
理化指标测定：氮含量（凯氏定氮法）；15N和13C丰度（DELTAV advantage同位素比值质谱仪）；Ndff和13C分布率；可溶性固形物（糖量计）和可溶性糖的含量（蒽酮比色法）；总游离氨基酸（茚三酮比色法）和可溶性蛋白质含量（Bradford法）。
组学研究：RNA-seq；TMT标记定量蛋白质组；广靶代谢组
主要结果与分析
1. 生理分析
Ndff是指各器官从肥料中吸收的15N相对于各器官总N的贡献率，它反映了各器官吸收和调节15N的能力。与对照相比，MHN和HN使果实、一年生枝条和叶片的Ndff值增加，并随施氮量的增加而增加（图1A），表明了果实对15N的吸收和调节最大，MHN和HN提高了新生器官对15N的吸收和调节能力。与对照相比，MHN和HN降低了果实的13C分布率，增加了营养器官（一年生枝和叶）的13C分布率（图1B），且MHN和HN果实中15N积累增加，而13C的积累减少。因此，MHN和HN提高了果实对15N的吸收和调节能力，减少了13C从营养器官向果实的分配。另外，MHN和HN使果实可溶性糖和总黄酮含量分别降低16.05%和19.01%（图1I，J），表明高氮条件下苹果果实品质恶化。此外，与对照相比，MHN和HN增加了总游离氨基酸（图1K）和可溶性蛋白质（图1L）的含量。CK和HN果实生理指标上不存在显著差异，因此选择这两个处理的果实样品进行后续的组学研究。
图1 苹果生理指标
2. 转录组分析
结果显示204个基因上调，545个基因下调，KEGG分析显示差异基因（DEGs）主要参与碳水化合物代谢、氨基酸代谢和其他次级代谢产物的生物合成（图2B）。此外，共鉴定出91种转录因子（TF），涵盖26个TF家族（图2C）。总的来说，大多数TF在高氮水平下下调。AP2-EREBP、MYB和bHLH是相对较大的TF家族。结果表明，这些显著变化的TFs在高氮胁迫下起着重要作用。
图2 转录组学分析
3. 蛋白质组分析
共获得5340个蛋白质，与对照相比，795个DEPs在HN中显示出显著变化，其中422个蛋白上调，373个蛋白下调。GO富集分析显示氧化作用−还原过程和应激反应富含更多的蛋白质，而下调的蛋白质富集程度更高（图3A）。KEGG分析发现C代谢、丙酮酸代谢、糖酵解/糖异生、三羧酸（TCA）循环、次级代谢产物生物合成和氨基酸生物合成途径显著富集（图3B）。MapMan分析结果显示许多DEP参与主要和次要CHO代谢、糖酵解、TCA循环、氨基酸代谢和次级代谢，并且大多数这些蛋白质被发现下调（图3C）。
图3 蛋白组分析
4. 广靶代谢组学分析
共鉴定到36个上调代谢物和47个下调代谢产物（图4B），包括类黄酮，碳水化合物、氨基酸和衍生物等（图4C）。KEGG富集分析表明差异代谢物（DAMs）主要在氨基酸生物合成、次生代谢产物生物合成、C代谢和类黄酮生物合成富集。碳水化合物中D-果糖6-磷酸和Dglucono-1,5-内酯的下调倍数最大，氨基酸和衍生物中，有四种下调，六种上调，其中高精氨酸的上调倍数最大。此外，结果还表明果实中积累的黄酮类化合物较少，且氮含量较高，尤其是鼠李素-3-O-芦丁苷和芦丁。
图4 HN与CK的代谢组学分析
5. 初级代谢的联合分析
C代谢包括淀粉和蔗糖代谢、糖酵解和TCA循环。高氮总体下调了C代谢中蛋白质（Susy、scrK和HK）的丰度和碳水化合物（蔗糖、葡萄糖和海藻糖）的积累。相反，糖酵解中间产物却明显积累，如甘油-P、甘油酸-3P和磷酸烯醇式丙酮酸。这表明蛋白质（ALDO、gapN和ENO）与这些中间代谢物之间存在负相关。糖酵解亚型的增加表明，高氮加速了C在呼吸途径中的流动。氨基酸与碳代谢密切相关，是氮分配的主要形式。氨基酸生物合成途径中的大多数蛋白质表达下调（脊索酸变位酶除外），而大多数氨基酸及其中间产物表达上调（图5）。以前的研究表明，随着氮供应的增加，非结构性碳水化合物中的一部分C被并入氨基酸和蛋白质中。以氨基酸形式的氮增加，使氮储存更具成本效益。因此，C向N代谢的转移是导致高氮条件下碳水化合物减少的一个重要因素，这使得水果中氨基酸和总氮含量的显著增加。甘油酸-3P和磷酸烯醇式丙酮酸的增加是氨基酸生物合成所需C骨架增加的重要指标。
图5 C代谢和氨基酸生物合成途径
6. 次级代谢联合分析
参与苯丙烷生物合成途径的蛋白质（4CL、CCR、C3′H和UGT72E）下调，下游代谢物东莨菪碱也显示下调趋势。相反，苯丙烷代谢的另一个分支的代谢产物（松柏醛和松柏醇）显著上调，这可能是由于苯丙烷途径分支之间的代谢通量重新定向，以应对高氮胁迫并维持苯丙烷代谢的动态平衡。黄酮类化合物来源于苯丙烷代谢途径，由C代谢诱导。参与类黄酮生物合成的基因（CCR、TCEA、F3H、DFR、ANS、BZ1和CYP75B1）和蛋白质（PGT1、F3H和ANR）表达下调。类似地，参与类黄酮生物合成途径的代谢物（根皮素、剑麻素、橙皮素-7-葡萄糖苷、三叶草素、槲皮苷、芦丁等）显示出下调趋势，其中，芦丁的表达下调幅度最大（图6）。在类黄酮生物合成途径中，发现许多TF可调节结构基因的表达。此外，在高氮条件下，C在初级和次级代谢中的分布可能是类黄酮生物合成下降的原因。
图6 苯丙素和类黄酮的生物合成途径
7. 共表达网络分析
基于Pearson相关分析（系数>0.9，P<0.05），筛选与初级代谢和次级代谢相关的基因、蛋白质和代谢物（图7）。获得5个hub基因和3个hub蛋白，其中MD07G1172700（编码PAL）包含在次级代谢中，MD05G1222800（编码argD）、MD16G1227200（编码leuC）、MD01G1174400（编码GLUD1_2）、MD02G1207200（编码tktA）、PFK、gapN，而HK则包含在初级代谢中。这些hub基因和蛋白质之间存在着相对较多的正相关节点。
图7 参与初级和次级代谢途径的基因、蛋白质和代谢物的共表达网络
总结
高氮增加了果实对15N的吸收和调节能力，降低了C在果实中的分配率，从而导致苹果果实的总N增加，总C和C/N比率降低。高氮破坏了苹果C−N平衡，降低了苹果果实的可溶性糖和总黄酮含量，进而使果实品质恶化。基于多组学分析，揭示了高氮对初级代谢和次级代谢互作网络。高氮调节了苹果果实中基因和蛋白质的表达，抑制了碳水化合物和黄酮类化合物的积累，更多的碳骨架被用来合成氨基酸及其衍生物并转移到氮代谢中。本研究揭示了高氮导致苹果果实糖和类黄酮含量下降的机理，并获得了关键候选基因和蛋白质。
参考文献
Wang F , Ge S , Xu X , et al. Multiomics Analysis Reveals New Insights into the Apple Fruit Quality Decline under High Nitrogen Conditions[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2021, 69(19).
京公网安备 11011302003368号