英文题目：GmST1, which encodes a sulfotransferase, confers resistance to soybean mosaic virus strains G2 and G3
中文题目：GmST1, 编码磺基转移酶, 赋予对大豆花叶病毒G2和G3株的抗性发表
期刊：Plant, Cell& Environment
影响因子：6.059
合作单位：东北农业大学大豆生物学教育部重点实验室/农业农村部东北大豆生物学与遗传育种重点实验室
研究背景
大豆[Glycine max（L.）Merr。]是一种在世界范围内种植的重要油料作物，是人类丰富的植物油和蛋白质来源。但许多病原体优先攻击大豆。这些攻击导致严重的产量损失和质量下降。在全世界攻击大豆的病原体中，大豆花叶病毒（SMV）是通过蚜虫和感染的种子非持久性传播的，是最广泛和破坏性最大的疾病之一。SMV感染通常会使大豆产量降低10–30％，但在严重暴发时，损失可能达到50–100％。根据大豆品种中SMV感染的症状，包括典型的叶片图案，叶片变形，植物发育不良，顶部坏死和种子斑点，将SMV菌株分为7种主要致病型：G1-G7。由于种子的可传播性，所有主要大豆生产国都存在菌株致病型（G1-G7）。目前，有4个主要的SMV抗性基因座（Rsv1，Rsv3，Rsv4和Rsv5），大豆基因组的可用性加快了分子标记的开发和Rsv基因座候选基因的鉴定。最主要的Rsv1基因座是最复杂的，它包含编码NBS-LRR蛋白的基因簇，这个染色体区域还携带多种病原体抗性基因，一大类同源NBS-LRR序列聚集在Rsv1基因座上，据推测，DNA的两个片段分别是3gG2（Glyma.13g190800的等位基因）和5gG3（Glyma.13g190000的等位基因），是Rsv1的最可能的候选基因，针对Rsv3，Rsv4也进行了相关的研究。尽管针对每个Rsv基因座筛选了候选基因，但除了Rsv4以外，没有一个关键基因被完全阐明。本研究中使用重组自交系RIL群体和F2分离群体，确定并精细绘制了SMV抗性基因座Rsvg2；分离候选基因的同时，使用表达分析和遗传转化测定法验证了其功能。最终发现，Rsvg2编码磺基转移酶（SOT），GmST1，与AtSOT15（AT5G07010）同源，为大豆对SMV的抗性提供了新的可能解释。
研究材料
352份栽培大豆种质材料，GWAS全基因组关联分析；
130份 F8:9 RIL群体材料（Dongnong93-046与Hefeng25作亲本杂交获得；Dongnong93-046，对SMV strains G2和G3抗性材料/Hefeng25，对strains G2和G3感性材料），构建极端混池（SMV-resistant and-susceptible gene pools, consisting of 30 lines each），BSA分析；
130份RIL群体材料，鉴定由GWAS和BSA联合定位并赋予SMV抗性的基因座；
1500份F2群体材料（Dongnong93-046和Hefeng25做亲本杂交获得），QTL分析；
Hefeng25，对SMV菌株G2和G3敏感的亲本株系，作为转基因受体；
上述大豆材料生长于温度25–26°C，光照周期16 h光照/ 8 h黑暗，相对湿度75％的温室，进行了人工SMV接种。
研究方法
大豆种质材料基因分型：SLAF-seq简化基因组测序；
大豆对SMV菌株G2的抗性初定位：GWAS分析（CMLM模型）；
抗性Rsvg2基因共定位：BSA和SLAF-seq关联分析；
抗性Rsvg2基因精细定位：Rsvg2区域遗传图谱构建，QTL定位；
GmST1序列变异鉴定与分析：PCR；
SOT酶活测定：ELISA；
GmST1候选基因的克隆与大豆遗传转化：GmST1 P
图1 Rsvg2基因座的精准定位
4. GmST1基因的多态性与SMV抗性相关
通过对22个大豆品系（包括10个抗SMV种质号和12个SMV易感种质）的GmST1基因序列分析，在GmST1基因的编码序列中鉴定出4个SNPs：两个同义和两个非同义（图1），而所有SNP都位于SOT结构域中，最终，由22个大豆品系中的4个SNP定义了6个GmST1单倍型，抗SMV品系由2种单倍型代表，而易感SMV品系由4种单倍型代表。针对BSA极端混池中每个个体中的GmST1序列进行比对分析，发现30个SMV抗性株中的GmST1序列与东农Dongnong93-046中的GmST1序列相同，而30个SMV感性株中的GmST1序列与和Hefeng25中的GmST1序列相同。GmST1编码序列第506位的2个SNP等位基因已通过SMV抗性进行明确划分，重组株序列分析表明：506位的TT等位基因对SMV G2菌株的抗性是必需的，将506位的TT [编码苯丙氨酸（Phe）]和CC [编码丝氨酸]等位基因分别命名为RSVG2-R和RSVG2-S（图1）。对75个大豆种质的进一步基因分型表明，所有7份抗SMV的种质均在GmST1的506位携带RSVG2-R等位基因，而其余68份对SMV敏感的种质均携带RSVG2-S等位基因。最后针对GmST1基因编码蛋白质的二级结构及SOT酶活性进行分析。这些结果表明，GmST1基因位于Rsvg2基因座，并且SMV的感染诱导了GmST1介导的SMV抗性。
5. GmST1的转录表达模式
通过qRT-PCR和RNA-seq对SMV抗性株系 Dongnong93-046和SMV-感性株系Hefeng25的不同组织进行分析，分析结果表明，GmST1基因受SMV感染调控，且该基因在抗SMV和易感SMV大豆品种之间存在差异表达(图2)。由抗性基因介导的乙烯，水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）等防御反应相关激素在不同植株中存在差异，研究结果发现：GmST1基因编码SOT，12-OH-JA在茉莉酸代谢途径中起作用，是SOT的直接底物。进一步研究表明GmST1基因可能参与了JA代谢途径，因此，RSVG2-R等位基因对SMV G2菌株的抗性可能取决于茉莉酸代谢途径。
图2 GmST1基因在抗SMV的Dongon93-046和SMV感的Hefeng25中的相对表达
图3 T2转基因植株（2-11、2-18和2-47）和非转基因植株“Hefeng25”在感染后表型
6. GmST1的过表达增强了大豆对SMV的抗性
为了测试过表达GmST1 RSVG2-R等位基因的过表达是否会增强转基因植物中SMV抗性，本研究进行了转基因过表达实验。使用农杆菌介导的转化方法获得了3株独立的T1转基因大豆植物。第一次接种SMV G2和G3菌株3周后，非转基因大豆植物的叶片比3种T2转基因植物的叶片表现出更典型的镶嵌症状（图3）。在15 dpi时，发现3种转基因植物中GmST1的相对表达水平显着高于非转基因植物，进一步推测GmST1的RSVG2-R等位基因提升了大豆对SMV G2和G3菌株的抗性。同时在对SMV外壳蛋白（CP）基因表达的qRT-PCR定量显示，在非转基因（对照）大豆植物中CP较高，GmST1的表达水平相对较低。
7. GmST1介导的大豆抗SMV的相关途径
研究中为了证明在RSVG2-S等位基因和RSVG2-R等位基因之间，GmST1对SMV应答的功能机制有所不同，且可能与JA信号通路相关（图4），进一步关注了RSVG2-R等位基因携带者（Dongnong93-046与转基因株系OE2-18）和RSVG2-S等位基因载体（Hefeng25）JA含量的转录本的变化，结果表明，内源性JA对SMV G2菌株有响应，且响应程度在GmST1的不同单倍型之间发生变化。最后基于RNA-seq数据，通过转基因与非转基因植株的比对，对JA信号通路相关基因进行研究，结果表明，在SMV G2菌株感染下，JA的合成和代谢在RSVG2-R等位基因携带者中比在RSVG2-S等位基因携带者中更活跃，作为JA信号传导途径中的受体蛋白编码基因，JAZ在具有不同GmST1等位基因的大豆品系之间具有差异表达，说明JA途径是由SMV感染诱导的，且GmST1介导的SMV抗性可能取决于JA防御反应。
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