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 分类: 群体遗传
2021年4月18日,Plant, Cell& Environment在线发表了由东北农业大学大豆生物学教育部重点实验室与北京百迈客生物科技有限公司合作并发表题为“GmST1, which encodes a sulfotransferase, confers resistance to soybean mosaic virus strains G2 and G3”的研究论文。文章中利用百迈客自主研发的简化基因组测序技术SLAF(Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing),结合GWAS,BSA,QTLs等群体基因定位研究方法,对大豆植株对大豆花叶病毒G2和G3株的抗性基因座进行精细定位,进一步通过转基因过表达,转录组等方法进行验证,最终发现GmST1基因, 其编码磺基转移酶, 赋予对大豆花叶病毒G2和G3株抗性。本期大师姐将为大家推送该文章整体研究思路及内容,希望能为大家在后续的群体功能基因定位研究中提供帮助。

英文题目:GmST1, which encodes a sulfotransferase, confers resistance to soybean mosaic virus strains G2 and G3

中文题目:GmST1, 编码磺基转移酶, 赋予对大豆花叶病毒G2和G3株的抗性发表

期刊:Plant, Cell& Environment

影响因子:6.059

合作单位:东北农业大学大豆生物学教育部重点实验室/农业农村部东北大豆生物学与遗传育种重点实验室

研究背景

大豆[Glycine max(L.)Merr。]是一种在世界范围内种植的重要油料作物,是人类丰富的植物油和蛋白质来源。但许多病原体优先攻击大豆。这些攻击导致严重的产量损失和质量下降。在全世界攻击大豆的病原体中,大豆花叶病毒(SMV)是通过蚜虫和感染的种子非持久性传播的,是最广泛和破坏性最大的疾病之一。SMV感染通常会使大豆产量降低10–30%,但在严重暴发时,损失可能达到50–100%。根据大豆品种中SMV感染的症状,包括典型的叶片图案,叶片变形,植物发育不良,顶部坏死和种子斑点,将SMV菌株分为7种主要致病型:G1-G7。由于种子的可传播性,所有主要大豆生产国都存在菌株致病型(G1-G7)。目前,有4个主要的SMV抗性基因座(Rsv1,Rsv3,Rsv4和Rsv5),大豆基因组的可用性加快了分子标记的开发和Rsv基因座候选基因的鉴定。最主要的Rsv1基因座是最复杂的,它包含编码NBS-LRR蛋白的基因簇,这个染色体区域还携带多种病原体抗性基因,一大类同源NBS-LRR序列聚集在Rsv1基因座上,据推测,DNA的两个片段分别是3gG2(Glyma.13g190800的等位基因)和5gG3(Glyma.13g190000的等位基因),是Rsv1的最可能的候选基因,针对Rsv3,Rsv4也进行了相关的研究。尽管针对每个Rsv基因座筛选了候选基因,但除了Rsv4以外,没有一个关键基因被完全阐明。本研究中使用重组自交系RIL群体和F2分离群体,确定并精细绘制了SMV抗性基因座Rsvg2;分离候选基因的同时,使用表达分析和遗传转化测定法验证了其功能。最终发现,Rsvg2编码磺基转移酶(SOT),GmST1,与AtSOT15(AT5G07010)同源,为大豆对SMV的抗性提供了新的可能解释。

研究材料

352份栽培大豆种质材料,GWAS全基因组关联分析;

130份 F8:9 RIL群体材料(Dongnong93-046与Hefeng25作亲本杂交获得;Dongnong93-046,对SMV strains G2和G3抗性材料/Hefeng25,对strains G2和G3感性材料),构建极端混池(SMV-resistant and-susceptible gene pools, consisting of 30 lines each),BSA分析;

130份RIL群体材料,鉴定由GWAS和BSA联合定位并赋予SMV抗性的基因座;

1500份F2群体材料(Dongnong93-046和Hefeng25做亲本杂交获得),QTL分析;

Hefeng25,对SMV菌株G2和G3敏感的亲本株系,作为转基因受体;

上述大豆材料生长于温度25–26°C,光照周期16 h光照/ 8 h黑暗,相对湿度75%的温室,进行了人工SMV接种。

研究方法

大豆种质材料基因分型:SLAF-seq简化基因组测序;

大豆对SMV菌株G2的抗性初定位:GWAS分析(CMLM模型);

抗性Rsvg2基因共定位:BSA和SLAF-seq关联分析;

抗性Rsvg2基因精细定位:Rsvg2区域遗传图谱构建,QTL定位;

GmST1序列变异鉴定与分析:PCR;

SOT酶活测定:ELISA;

GmST1候选基因的克隆与大豆遗传转化:GmST1 P

图1 Rsvg2基因座的精准定位

4. GmST1基因的多态性与SMV抗性相关

通过对22个大豆品系(包括10个抗SMV种质号和12个SMV易感种质)的GmST1基因序列分析,在GmST1基因的编码序列中鉴定出4个SNPs:两个同义和两个非同义(图1),而所有SNP都位于SOT结构域中,最终,由22个大豆品系中的4个SNP定义了6个GmST1单倍型,抗SMV品系由2种单倍型代表,而易感SMV品系由4种单倍型代表。针对BSA极端混池中每个个体中的GmST1序列进行比对分析,发现30个SMV抗性株中的GmST1序列与东农Dongnong93-046中的GmST1序列相同,而30个SMV感性株中的GmST1序列与和Hefeng25中的GmST1序列相同。GmST1编码序列第506位的2个SNP等位基因已通过SMV抗性进行明确划分,重组株序列分析表明:506位的TT等位基因对SMV G2菌株的抗性是必需的,将506位的TT [编码苯丙氨酸(Phe)]和CC [编码丝氨酸]等位基因分别命名为RSVG2-R和RSVG2-S(图1)。对75个大豆种质的进一步基因分型表明,所有7份抗SMV的种质均在GmST1的506位携带RSVG2-R等位基因,而其余68份对SMV敏感的种质均携带RSVG2-S等位基因。最后针对GmST1基因编码蛋白质的二级结构及SOT酶活性进行分析。这些结果表明,GmST1基因位于Rsvg2基因座,并且SMV的感染诱导了GmST1介导的SMV抗性。

5. GmST1的转录表达模式

通过qRT-PCR和RNA-seq对SMV抗性株系 Dongnong93-046和SMV-感性株系Hefeng25的不同组织进行分析,分析结果表明,GmST1基因受SMV感染调控,且该基因在抗SMV和易感SMV大豆品种之间存在差异表达(图2)。由抗性基因介导的乙烯,水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)等防御反应相关激素在不同植株中存在差异,研究结果发现:GmST1基因编码SOT,12-OH-JA在茉莉酸代谢途径中起作用,是SOT的直接底物。进一步研究表明GmST1基因可能参与了JA代谢途径,因此,RSVG2-R等位基因对SMV G2菌株的抗性可能取决于茉莉酸代谢途径。

图2 GmST1基因在抗SMV的Dongon93-046和SMV感的Hefeng25中的相对表达

图3 T2转基因植株(2-11、2-18和2-47)和非转基因植株“Hefeng25”在感染后表型

6. GmST1的过表达增强了大豆对SMV的抗性

为了测试过表达GmST1 RSVG2-R等位基因的过表达是否会增强转基因植物中SMV抗性,本研究进行了转基因过表达实验。使用农杆菌介导的转化方法获得了3株独立的T1转基因大豆植物。第一次接种SMV G2和G3菌株3周后,非转基因大豆植物的叶片比3种T2转基因植物的叶片表现出更典型的镶嵌症状(图3)。在15 dpi时,发现3种转基因植物中GmST1的相对表达水平显着高于非转基因植物,进一步推测GmST1的RSVG2-R等位基因提升了大豆对SMV G2和G3菌株的抗性。同时在对SMV外壳蛋白(CP)基因表达的qRT-PCR定量显示,在非转基因(对照)大豆植物中CP较高,GmST1的表达水平相对较低。

7. GmST1介导的大豆抗SMV的相关途径

研究中为了证明在RSVG2-S等位基因和RSVG2-R等位基因之间,GmST1对SMV应答的功能机制有所不同,且可能与JA信号通路相关(图4),进一步关注了RSVG2-R等位基因携带者(Dongnong93-046与转基因株系OE2-18)和RSVG2-S等位基因载体(Hefeng25)JA含量的转录本的变化,结果表明,内源性JA对SMV G2菌株有响应,且响应程度在GmST1的不同单倍型之间发生变化。最后基于RNA-seq数据,通过转基因与非转基因植株的比对,对JA信号通路相关基因进行研究,结果表明,在SMV G2菌株感染下,JA的合成和代谢在RSVG2-R等位基因携带者中比在RSVG2-S等位基因携带者中更活跃,作为JA信号传导途径中的受体蛋白编码基因,JAZ在具有不同GmST1等位基因的大豆品系之间具有差异表达,说明JA途径是由SMV感染诱导的,且GmST1介导的SMV抗性可能取决于JA防御反应。

图4 SMV抗性Dongnong93-046和对SMV性Hefeng25中的GmST1基因表达分析
参考文献:
Xue Zhao, Yan Jing, Zhenghui Luo, Sainan Gao. (2021). GmST1, which encodes a sulfotransferase, confers resistance to soybean mosaic virus strains G2 and G3. Plant, Cell& Environment.
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